人胃贲门腺癌组织和正常胃黏膜组织蛋白质组双向电泳图谱的差异分析

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1、人胃贲门腺癌组织和正常胃黏膜组织蛋白质组双向电泳图谱的差异分析刘国红，杨继要，呼琳，张钦宪★（郑州大学基础医学院组胚教研室，郑州，450052）关键词蛋白质组学;双向电泳;贲门腺癌中图分类号R735.2文献标识码：A贲门癌(Gastriccardiaadenocarcinoma，GCA)是我国北方常见的恶性肿瘤之一,其最显著的流行病学特征是与食管癌地域分布的一致性。在食管癌高发区河南省林州市及其相邻地区,贲门癌与食管癌发病率之比为1∶3.2,并且预后极差[1],目前仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因。目前GCA发病机制尚不明确，关于GCA的蛋白质组学研究少见报道。随着双向电泳技术

2、和质谱分析等蛋白质组学相关技术的迅猛发展，从蛋白质组整体水平研究肿瘤已成为可能。本研究采用双向电泳技术分离贲门腺癌与正常胃黏膜组织总蛋白，获得两组的蛋白质表达谱，通过Imagemaster6.0软件分析，寻找差异表达蛋白质，以期从蛋白质组整体水平研究贲门腺癌发生、演变过程中蛋白质表达变化，为阐明贲门腺癌发病分子机制、筛选早期诊断的特异性指标提供实验依据。1材料与方法1.1标本8例贲门腺癌标本取自郑州大学一附院手术患者，男性6例，女性2例。正常胃黏膜取自距贲门腺癌组织边缘5cm以外部位，病理确认无增生和癌变。1.2主要试剂和仪器pH3～10、11cm线性IPG胶条、尿素、硫脲、C

3、HAPS、DTT、碘乙酰铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硫代硫酸钠、硝酸银、EDTA、低熔点琼脂糖；PROTEINIEFCELL等电聚焦仪、PROTEANIixicell电泳仪、magicscan图像获取仪、Imagemaster6.0凝胶图像分析软件。1.4方法1.4.1组织蛋白提取和定量取贲门腺癌或胃黏膜组织100mg剪碎，移入匀浆器，加入1ml组织裂解液于冰上匀浆，室温静置30min，转入1.5mlEP管，冰上超声破碎5min。15000g离心30min,取上清再离心20min,取上清即为组织总蛋白，BrandFord法测蛋白浓度，分装，-80℃保存。1.4.2双向电泳（2

4、-DE）第1向等电聚焦电泳：参考PROTEINIEFCELL等电聚焦仪操作指南进行。本实验采用11cm线性PH3～10IPG胶条，蛋白上样量100µg，水化上样总体积200µl。第2向垂直电泳：胶条平衡后转入12.5%SDS-PAGE分离胶，PROTEANIixicell电泳仪上进行垂直电泳。1.4.3凝胶银染、图像扫描和分析凝胶银染后magicscan扫描仪获取2-DE图像，Imagemaster6.0软件分析。蛋白质点变化（以vol%表示）[2]在贲门腺癌和胃黏膜间增多或减少2倍以上认定表达有差异。2结果经双向电泳获得了蛋白斑点清晰、重复性好的贲门腺癌和正常胃黏膜2-DE图

5、谱（图1）。经Imagemaster6.0软件分析，蛋白主要分布在PI4～7、相对分子质量（20～90）×103范围内，贲门腺癌组平均蛋白点数843±29个，平均匹配率76.9%。胃黏膜组平均蛋白点数827±36,平均匹配率80.3%。两组间有47个差异表达蛋白，29个在癌组织高表达，18个低表达（图2）。IEFPI310IEFPI310SDS-PAGESDS-PAGEAB图1贲门腺癌组织(A)与胃黏膜组织（B）2-DE图谱BA图2贲门腺癌(A)与胃黏膜组织(B)2-DE图谱部分差异蛋白点放大图3讨论贲门癌是指发生于食管贲门接合线以下2cm、鳞状上皮和腺上皮交界区的胃贲门部的癌

6、。近30年来,贲门癌的发生率呈稳定上升趋势,而胃远端肿瘤却明显下降。贲门癌的发病机制尚不清楚,可能与Barrett食管、贲门部肠化生、幽门螺杆菌、胃食管反流性疾病等因素相关[3]。因解剖位置的关系，贲门癌在发病情况、临床症状、病理特征和治疗方面都有其特殊性。此种特殊病种,诊断容易延误,恶性程度高,以致疗效欠佳,已引起临床关注。肿瘤蛋白质组学研究可以动态、整体、定量检测肿瘤发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变[4]，从蛋白质组整体水平比较肿瘤组织/细胞与正常组织/细胞之间的蛋白质表达差异，可从中发现肿瘤诊断、预后和治疗的分子标志。蛋白质组学技术结合生物信息学对癌症相关蛋白进行筛选

7、和鉴定，为发现新的肿瘤标志物提供了新方法[5]。2-DE技术是目前蛋白质组学研究中分离蛋白质的主要技术[6]，相同条件下利用2-DE技术分离贲门腺癌和正常胃黏膜组织蛋白，获得分辨率高、重复性好的2-DE图谱，是筛选差异表达蛋白质的基础。本研究以贲门腺癌组织为研究对象，对2-DE技术的程序及有关环节（如样品处理、电泳参数和上样量）进行反复改进和优化，初步建立了一套适合贲门腺癌蛋白质组研究的方法。作者对8例贲门腺癌和胃黏膜组织总蛋白进行双向电泳分离，获得的2-DE图谱分辨率高、蛋白点位置重复性好