人宫颈癌组织及癌旁正常组织蛋白质组的比较研究论文

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1、人宫颈癌组织及癌旁正常组织蛋白质组的比较研究论文【摘要】目的:构建人宫颈癌组织及癌旁组织双向凝胶电泳图谱，筛选差异表达的蛋白质.方法:人宫颈癌组织及癌旁正常组织标本10例，应用固相pH梯度双向凝胶电泳后，ImageScanner扫描图像、ImageMaster2DEElite4.01软件分析识别差异表达的蛋白质；应用质谱仪得到相应的肽质指纹图谱，联网ExPASY网站查询相关数据库鉴定获得的差异蛋白质点.结果:癌组织和癌旁正常组织凝胶的平均蛋白质点数分别为1285±85和1063±76，凝胶上蛋白质点位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在等

2、电聚焦方向的偏差是（1.78±0.18）mm，在SDSPAGE方向上的偏差为（1.89±0.21）mm；比较10例宫颈癌组织及癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱.freel）10例取自海南医学院附属医院、海南省人民医院、海南省妇幼保健院的宫颈癌手术切除标本，并经病理检查确诊.所有标本用生理盐水反复清洗去除血液，并尽可能剪去多余的组织.处理后的样品用于蛋白质的抽提，或置于-80℃保存待检.1.2方法1.2.1双向凝胶电泳称取50mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，用500μL裂解液充分涡旋混匀，置于37℃孵育1h，取出后再充分涡旋混匀，4℃离心

3、30min，吸取上清，应用三氯醋酸沉淀法将其沉淀以去除多糖.蛋白质纯化后，用Bradford法测定蛋白质的浓度.等电聚焦按IPGphor等电聚焦系统指南进行.先定量样品蛋白质和上样，水化和等电聚焦，IPGS平衡，SDSPAGE，参数设置，在20℃下自动进行，总电压时间积为61480V·h，SDSPAGE按2.5aster2DElite4.01分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1D校正、建立平均凝胶等分析.1.2.2质谱分析及蛋白质鉴定随机选取差异较明显的蛋白质点20个，另选取在两块胶上认为匹配的点以及空白胶（溴酚蓝线以外

4、的胶）作为对照，置于ProFlexTMⅢMALDITOF质谱仪分析.以基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，对肽质量指纹图谱进行校正，获得了肽质量指纹图.联网至ExPASY网站（.expasy.org/），应用PeptIdent软件进行查询上述试验获得蛋白质点的肽质指纹数据.统计学处理:数据以x±s表示，用SPSS10.0软件分析结果.2结果2.1人宫颈癌组织及对应癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱同一标本的总蛋白质选择上样量为0.5mg,进行3次重复性的检测，发现每次电泳图谱非常相似.Imagescanner扫描仪扫描获取图像后，通

5、过软件对其进行点分析，结果发现宫颈癌组织蛋白质斑点总数为1285±85，癌旁正常组织蛋白质斑点总数为1063±76，大部分蛋白质点主要分布在Mr为30000～97000，等电点PI4～6的区域（图1A,B）.任意选取同一癌组织的3块胶中相互匹配且分辨清晰的20个蛋白质点，选择位置偏于中间的点作为参与的基准点，以参考胶为参考位置，测量出其他两块胶对点在第一向等电聚焦（IEF）及第二向SDSPAGE方向上位置的偏差，发现凝胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向上的偏差为（1.78±0.18）mm，在SDSPAGE方

6、向上的偏差为（1.89±0.21）mm，获取重复性较好的2DE图谱，有利进一步进行蛋白质组差异分析.2.22DE蛋白质图谱蛋白点匹配分析提取蛋白质并进行2DE，发现蛋白质银染图谱较相似，建立了平均凝胶图谱，并进行点检测.当同一蛋白质点的表达量在某一类型组织凝胶上较其他类型组织凝胶明显增强（校正后蛋白质点的表达量相差3倍以上），视其为未匹配蛋白质点，经软件分析2DE图谱，结果发现人宫颈癌组织及癌旁正常组织的不匹配的蛋白质点为156±18.宫颈癌组织凝胶中有85±7个未匹配蛋白质点，其中18为个差异蛋白质点（图1A中标号为1~18的蛋白质

7、点）；癌旁正常组织凝胶中有71±9个未匹配蛋白质点，其中有13个差异蛋白质点（图1B中标号为A~M的蛋白质点）.差异蛋白质点数18∶13.2.3差异蛋白质点的肽质指纹图分析通过软件分析人宫颈癌组织及癌旁正常组织差异表达的蛋白质，选择差异蛋白质点，经切割、脱色、还原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取、脱盐后，用MALDITOFMS并以基质峰、酶自动降解片段峰（m/z1993.9772Da）进行校正，测得各自的肽质量指纹图谱（PMF）.31个差异蛋白质点获得了23张PMF.进入.expasy.org界面，应用PeptIdent查询软件在设定查询参数

8、条件下将MALDITOFMS测得各自的肽质量指纹图谱搜索SBL数据库，联合搜索结果及2DE图谱上相应点的表观等电点、分子质量、匹配肽段的多少（4个片段以上）及