第9章层析技术200506

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1、第9章色谱法知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸附层析技术，离交层析技术，牛物亲和层析技术，分配层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这些技术。难点：常用层析法的分类及其合理选用。1.色谱（层析）技术概述色谱（层析）法，尤其是液相色谱法是生物技术重要的分离纯化方法，广泛应用于肽、多糖、酶和蛋白质等生物活性物质的实验室研究和大规模工业化生产中。随着生物技术的发展，出现了许多以柱色谱为基础的分离系统，如快速蛋白质液相色谱系统FPLC、小试自动化色谱系统BioP让ot和全自

2、动牛产规模色谱BioProccss标准系统，以及“超级吸附分离”新工艺及径向色谱柱等新设备，大大提高了色谱分离装置的生产能力及分离介质的利用率，年处理量为儿万吨至十几万吨的色谱分离装置也开始被工业化牛-产采用。色谱发展历史示于表lo表1色谱发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、

3、3-和7■胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。19

4、41Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年被授予诺贝尔化学奖1944Consden等发明了纸色谱。1949Mac1lean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDccmtcr等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Gid

5、dings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离•了色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。1.色谱法的分类:色谱是样品混合液中各组分在固定相和流动相之间的一类差别分离。其机理尽管多种多样，但总是与样品混合液在流经色谱介质时溶质相对于溶剂前缘阻滞现象有关。当流动相流过固定相时，由于易与固定相结合的物质移动速度较慢，而易与流动相结合的物质移动速度较快，因而不同的物质受到了不同程度的差别阻滞作用，使混合物得到分离。根据色谱基本原理划分的各种色谱法各具特色（表2）,往往儿种方

6、法配合使用能得到最佳效果。表2色谱分类简介分类原则类型特征据溶质分子与固定相相互作用的机理不同吸附色谱离子交换色谱疏水作用层金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离了交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同筑基化合物的銃基与固定相表面的•二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分了大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同进行分离据实验技术低压色谱中压色谱高压色谱电泳操作压力小于0.5MPa操作压力在0.5〜5MPa之间操作压力在5〜40MPa之间溶质分子在电场

7、中的移动速度不同据固定相的形状不同柱色谱纸色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素拜基结合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不同气相色谱液相色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为液态流动相为液态按操作方式不同迎头法顶替法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质來洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层消楚，但层与层相连，故不能将组分分离洗脱法吸附色谱与其它色谱法的异同点示于表3。表3吸附色谱与其它色谱法的异同点类型机理优点缺点适用

8、范围吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶过滤色谱分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起各种凝胶介质昂贵，处理分了量有明显差别的可溶性生物大变性量有限制分子分配色谱溶质在固定相和流分辨力高，重复性较影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定动相中分配系数的好，能分离微杲物质差异亲和色谱亲和色谱生物大分分辨力很商一种配体只能用于一种生各种生物大分子子与配体之间有特物大分子，局限性大殊亲和力聚焦色谱等电点和离子交换分辨力高进