第5章沉淀技术200506

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1、第5章沉淀技术知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。重点：上述儿种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因索对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。难点：常川沉淀方法的灵活运川。一、沉淀技术概述：在生物医药工业和屮药现代化行业，作为传统初级分离手段的沉淀技术是指因理化因素的改变引起牛•化活性物质的溶解度降低，导致固体成相的现象。与结品的规则品体和比，沉淀是无定形的固体颗粒，组成成分复杂，其纯度远低于品体。目前，沉淀技术广泛应用于实验室和工业规模蛋白质、猶、核酸、多糖等生物大分子物质和黄酮、生物碱

2、、皂或等生物小分子物质的回收、浓缩和纯化。沉淀技术可以分为：盐析法、冇机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、等电点沉淀、非离了型聚合物沉淀、聚电解质沉淀和高价金属离子沉淀法等。本节将以蛋口质沉淀为例，介绍沉淀技术的原理、各种沉淀方法的特点与选择原则。在介绍沉淀技术之前，首先对目标蛋口质的理化性质做一个简单的回顾。蛋白质按功能可分为活性蛋白与非活性蛋白，活性蛋白有：酶、激素蛋白、运输和贮存蛋片、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白等;非活性蛋白如：胶原蛋口，角蛋白等。通常，大部分蛋口质可溶于稀盐、稀酸、稀碱和水屮，蛋口质在不同溶剂屮的

3、溶解度差异主要取决于其白身分子结构性质（如亲疏平衡值各不相同的氨基酸组成等内因）和溶剂的理化性质（如温度、pH值和离子强度等外因）。因而，对用不同的溶剂或缓冲液捉取、分离、纯化蛋白质和酶。凡质点人小在1-100mn范围内所构成的分散系统称为胶体。蛋白质分子的肓径一•般在2-20血范围内，且蛋白质分子衣面分布着与水分子结合的亲水氨基酸的极性R基。因此，天然蛋白质溶液得以保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于：水化作用（水化膜的存在,能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集）和电荷的排斥作用（两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集）。当改变蛋白质的质点人小，电荷悄况

4、和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液屮沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用。因此，在生物人分子的分离纯化中，常利用蛋口质的沉淀作用来分离和制备蛋口质和酶。如：采用盐析法从鸡蛋壳中捉収溶菌酶和采用乙醇分级沉淀血浆蛋0。由于蛋白质是两性生物大分子电解质，在水溶液中，蛋白质表面存在不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区。蛋口质和氨基酸i样，既含有酸性的基团乂含有碱性的基团，在特定的pH范围内能解离产牛带正电荷或带负电荷的基团。对于某一特定蛋口质而言，当在某一pll时，其所带电荷正负相等（即静电荷为0）,这一pH值被称为蛋白质的等电点（PI）

5、。蛋白质处于等电点时，其电导率、渗透压，粘度及溶解度等性质均处于最低值，因此，通常利用蛋片质的两性解离和等电点特性來沉淀蛋白质。如：牛奶酪蛋白的等电点沉淀。当天然蛋白质受到某些物理因素（加热、紫外线、X射线和超声波处理等）和化学因素（强酸、强碱、尿素、乙醇和TCA等）的影响后，由于氢键、盐键等次极键维系的高极结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质，物理化学性质改变。这种现彖称为蛋白质的变性作用。变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度降低、粘度增大、分子扩散速度增大、渗透压降低、等电点改变、牛物活性降低或丧失和易被酶水解等。因此,在制备

6、酶制剂或生物活性物质时应防止蛋白质变性的发生。但蛋白质的变性作用可用于选择性变性沉淀中去除杂质。如：从啤酒酵母泥屮提取醴脱氢酶就是釆用选择性热变性沉淀的方法去除朵蛋口。综上所述，由于蛋白质周围的水化层利蛋白质分子间的静电排斥作用是防止蛋白质沉淀的两种屏障。因此，可通过降低蛋白质周I韦I的水化层和双电层厚度（g电位），来降低蛋白质溶液的稳定性，从而实现蛋口质的沉淀。水化层厚度和&电位与溶液性质（如电解质的种类、浓度、pH等）密切相关，所以，蛋口质的沉淀可采用恒愠条件下添加各种不同试剂的方法，如加入无机盐的盐析法、加入酸碱调节溶液pH的等电点沉淀法、加入水溶性有

7、机溶剂的有机溶剂沉淀法等来实就。二、各种沉淀技术1盐析法盐析沉淀工艺常在发酵液预处理之后，操作步骤通常按三步进行：酋先加入沉淀剂，笫二步为沉淀物的陈化，笫三步为离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都侑很人彩响。由于盐析沉淀的产物屮盐含最较高，一般在盐析沉淀麻，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作（如层析、结品）。1.1盐析的机理当向蛋口质溶液中逐渐加入电解质吋，开始蛋口质的溶解增人，这是山于蛋口质的活度系数Y降低的缘故，这种现彖称为盐溶；当继续加入电解质时，由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水

8、分子就离开蛋白质的周围，暴露出憎水区域，憎水区域间的