rt-pcr常见问题与分析（转）

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1、RT-PCR常见问题与分析(转)2011-02-2413:53:111分类：生物技术

2、标签：学习

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4、字号订阅在琼脂糖凝胶分析屮看到少量或没有RT-PCR产物？参考见解：仁RNA被降解：在用來验证完整性Z前先在变性胶上分析RNA：使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出麻立刻处理；在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45°C或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNaseo而且，在＞0.8mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；2、RN

5、A中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25pg到0.4pg/pl)以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS,EDTA,甘油，焦磷酸钠，亚粘胺，甲酰胺和脈盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂；3、多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；4、用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对丁-随机六聚体,建议在反应温度保温Z前先在25°C保温10分钟；对于

6、基因特异性引物(GSP),4以试-下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列；5、起始RNA量不够：增加RNA量；对T＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成屮使用0.1pg至ij0.5pg乙酰BSA；6、RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提高逆转录反应温度，对Superscript1【可以到50°C,对ThermoScript可以到65°C。注意:不要在＞60°C时使用oligo(dT)引物，选择-个在反应温度可以退火的GSP

7、；对于＞1kb的RT・PCR产物，保持反应温度＜65°Co注意：不耍在高丁37°C时使用M-MLV；如果不需要全长cDNA,在第-•链反应屮使用随机引物;7、引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。&靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。9、PCR没有起作用：对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤屮使用超过1/5的逆转录反应产物；10、PCR引物设计较差：避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介T0.1HM到0.

8、5pM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测屋光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。11、富含GC的模板：于GC含量＞50%的模板，使用PCRxEnhancerSolutiono12、镁离子浓度太低：从4mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR,使用3mM至的镁离子浓度。13、退火温度太高：使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm5°C。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。在琼脂糖凝胶分析

9、中观察到非预期条带？参考见解：1、弓I物和模板非特异性退火：在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2、GSP设计较差：遵循用于扩增引物设计的同样原则。3、RNA中沾染了慕因纽DNA：使用扩增级DNaseI处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。4、形成引物二聚体：设计在3端没有互补序列的引物。5、引物和模板非特异性退火：以2°C到5°C间隔增加退火温度，减少退火时间；在开始几个循环使用较髙的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用Pl

10、atinumTaqDNA进行白动热川动PCR；避免在引物$端含有2到3个dG或dC；6、镁离子浓度太高：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。7、因为扩增复杂模板导致引物错误起始：使用巢式PCR或递减PCR。&沾染外源DNA：使用抗气雾剂的吸头和UDGo9、因为二级结构导致引物结合位点无法接近：对于GC含星＞50%的模板，使用（1x・3x）PCRxEnhancerSolutiono定址RT-PCR无扩增产最相対荧光信号小于等于背景或没有模板対照？参考见解：1、无cDNA合成。2、cDNA合成温度太高

11、：降低保温温度。3、反转录cDNA产物被二级结构封闭：提高保温温度。重新设计引物。4、RNA被损害或降解：必要的话更换RNA。5、RNAse污染：维持无菌条件；加入RNase抑制剂。6、荧光探针无功能：确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。丿IJDNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。灵敏度低，须在比预期更高的循环屮检出产物？参考见解：仁初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度；使用10