pcr、rt-pcr常见问题分析

《pcr、rt-pcr常见问题分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR常见问题分析及解决方案重庆升博生物科技有限公司SHENGBOBIOTECHCO.,LTD.反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度浓度适当引物设计长度适当、避免二级结构和二聚体合成质量浓度50uL体系引物加量为10-20pmol反应体系对PCR扩增的影响反应BufferpH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当，避免反复冻融ddH2OpH值适当，避免污染反应BufferpH、盐离子、稳

2、定剂、增强剂提供缓冲环境Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当，避免反复冻融ddH2OpH值适当，避免污染反应BufferpH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当，避免反复冻融ddH2OpH值适当，避免污染如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶（PCR实验的不同需求）1Taq酶2pfu酶3HotstartTaq酶TaqplusLongTaqTaqplatinum4混合酶4混合酶——高扩增效率＋高保真度Taqplu

3、sTaq+pfu用于复杂模板（GCrich,二级结构）扩增大多数情况下可替代Taq,特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb。LongTaqTaq+pfu超长片断扩增，15-40kb.TaqplatinumHotStart+pfu高扩增效率＋高保真度预配的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂PCRMasterMixPCR常见问题分析PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增或拖尾假阳性问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品A样品B正对照纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：全长结构：二级结构原因对策纯化

4、模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反转录酶用温度高的反转录酶无扩增产物之模板原因引物错误引物设计不好引物降解引物合成、纯化不好原因对策合成前检查评价、重新设计引物换一管新引物免费重新合成无扩增产物之引物原因退火温度延伸时间循环次数原因对策递度PCR聚合酶的延伸速度适当增加循环数无扩增产物之PCR条件原因现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增M12引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度

5、适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数非特异性扩增提高PCR特异性的策略巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（TouchDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂四种策略前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹

6、分析等。策略之二递减PCR（TouchDownPCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度通常选择热启动Taq酶热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一策略之三热启动PCR甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区增强剂浓度要适当策略之四使用PCR增强剂RT-PCR简介主要内容RT-PCR原理RT-PCR步骤常见问题分析SuperRnaseH-ReverseTranscriptase3’5’TTTTcD

7、NATTTTcDNA……PCR扩增5’3’mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3’5’3’5’一步法RT-PCR两步法与一步法RT-PCR比较两步法一步法引物OligodT，随机引物，GSPGSP优点PCR扩增失败时便于分析原因特异性和灵敏度高适用检测多种目的基因半定量RT-PCR大量样品分析定性分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针RT-PCR主要用途逆转录酶的选择AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60℃（Bioflux公司）。MMLV：Moloney鼠白血病病毒，逆转录酶

8、，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42℃（赛百盛）SuperRNaseH-ReverseTranscriptaseMMLV反转录酶的RNaseH-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）RNase