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1、RT-PCR简介点击：2815  作者：  来源： 时间：2007-03-07　本站论坛主要内容RT-PCR原理RT-PCR步骤常见问题分析两步法RT-PCR一步法RT-PCR两步法与一步法RT-PCR比较··RT-PCR主要用途分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针逆转录酶的选择AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60℃（Bioflux公司）。MMLV：Moloney鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42℃（赛百盛）SuperR

2、NaseH-ReverseTranscriptaseMMLV反转录酶的RNaseH-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）RNaseH的作用水解RNA-DNA杂合链中的RNART-PCR引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。Oligo(dT15-18)：适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已

3、知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。提高RT-PCR灵敏度1.分离高质量RNA2.使用无RNaseH活性的逆转录酶3.提高逆转录酶保温温度4.减少基因组DNA污染RT常见问题·PCR与RT-PCR技术·点击：5819  作者：  来源：日期：2007-03-07   本站论坛PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30

4、个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是TaqDNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他

5、参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。表1.反应成分ComponentFinalConcentrationTemplate10^4-10^6copiesofDNAtemplatePrimer10.1-0.5µMPrimer20.1-0.5µM10XReactionbuffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTPmix200mMeachdNTPThermostableDNApolymerase1-4units/100mlreactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cD

6、NA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。

7、在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。图1.RT-PCR概图 增加RT-PCR灵敏度分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

8、Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。TRIzol®试剂步骤略图一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产