中医不同治法拮抗大鼠iri心肌细胞凋亡的分子机制研究

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果中医不同治法拮抗大鼠IRI心肌细胞凋亡的分子机制研究【摘要】目的观察中医不同治法对大鼠心肌缺血再灌注诱导细胞凋亡及Caspase-3和NF-κB表达的影响。方法建立大鼠动脉粥样硬化在体心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数，免疫组化、ESMA法观察心肌细胞Caspase-3及NF-κB因子表达。结果中医不同治法均能降低AI；补气法、活血法能够抑制Caspase-3及NF-κB的表达，而化痰法对以上因子的表达无明显影响。结论中医不同治法

2、可能通过不同途径抑制I/R心肌细胞发生凋亡，从而对I/R心肌具有保护作用。　　　　【关键词】补气法；活血法；化痰法；心肌缺血再灌注损伤；细胞凋亡；Caspase-3;NF-κB　　　　心血管疾病常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是一种多因素参与的复杂病理生理过程，涉及到多个环节。但无论由哪种途径引起的心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemiareperfusion课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解

3、，特别是博士生必须有创新性的成果injury，MIRI)，最终均可导致心肌细胞结构的改变和破坏。为此，笔者在动脉粥样硬化大鼠MIRI模型上，观察中医补气、活血、化痰不同治法对大鼠心肌缺血再灌注后心肌超微结构影响，并观察Caspase-3及NF-κB的表达，从分子水平探讨补气、活血、化痰不同中医治法拮抗MIRI细胞凋亡机理的异同，以期更加客观和直接地揭示中医不同治法的心肌保护效应，为进一步临床应用提供依据。　　1材料与方法　　主要药物与试剂　　药物制备给药剂量和给药方式保元汤、血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤水煎剂按照参考文献［1］制备；保元汤以成人等效量生药/kg体重灌胃，血府逐瘀汤以成人等

4、效量生药/kg体重灌胃，瓜蒌薤白半夏汤以成人等效量生药/kg体重灌胃，给药体积均按1ml/100g计算，于缺血再灌注前30min给大鼠灌胃，缺血再灌注组注入等量生理盐水。　　试剂原位细胞凋亡检测试剂盒、鼠抗Caspase-3单克隆抗体以购自美国sigma公司，NF-κBP65抗体(一抗)和Westernblotluminolreagent购自美国satuscruzs公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)购自北京中山公司;T4多核苷酸激酶和NF-κB探针购自美国Promega公司；［r-32p］ATP购自北京亚辉公司。　　1.动物模型制备及分组健康雄性wistar大鼠50只，体重2

5、50～300g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。参照参考文献［2］的方法，制备高脂乳剂，按10课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果ml/kg灌胃，每日1次，连续12周，造成大鼠AS模型。随机分成5组，即假手术组、IRI模型组(I/R组)、补气法组、活血法组、化痰法组，每组10只动物。　　在大鼠AS模型的基础上，手术建立大鼠MIRI模型：大鼠称重后氯胺酮80mg/kg经腹腔注射麻

6、醉。气管切开接呼吸机人工呼吸，记录Ⅱ导联心电图。开胸后以左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉。以心电图ST段明显抬高、结扎点远端心肌发绀为结扎成功标志。结扎冠状动脉左前降支30min，复流h。sham组只穿线不结扎冠脉。　　1.检测指标与方法　　心肌凋亡细胞原位检测采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素平移末端标记技术-TUNEL法(TdT-mediateddUTPendlabeling)标记凋亡心肌细胞。按试剂盒说明书进行。TUNEL阳性反应为核呈棕褐色或棕黄色颗粒。核呈TUNEL阳性反应且具备细胞凋亡的形态学特征者被判定为凋亡细胞。在每张玻片上随机取4个高倍视野(4

7、00×)，计数每个视野凋亡细胞总数，并计算凋亡指数(ApoptosisIndex，AI)。　　表达检测二步法免疫组化法测定，参照试剂盒说明操作，1∶50稀释，兔二步法检测试剂盒(PV-6001)购自北京中杉公司，胞浆或胞核显示黄棕色颗粒为染色阳性。　　κB表达检测凝胶电泳迁移率(EMSA)法定：称取各组心肌组织课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等