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1、讨论补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响 脑缺血后由于脑组织缺血、缺氧引起缺血半暗区神经元变性、坏死,而导致神经功能缺损,因此,尽快恢复缺血区的血液供应对缺血后神经功能的恢复至关重要,而缺血半暗区血流的恢复有赖于侧支循环的建立。血管新生是改善脑组织血流供应的一种有效方法,对中风患者的预后十分关键,是近年来中风研究的热点之一。补阳还五汤是中医治疗缺血性脑损伤的有效经典方剂,前期研究表明,补阳还五汤能显著提高局灶性脑缺血模型大鼠神经功能,增强脑缺血后血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfacto
2、r,VEGF)及其受体Flk1的表达,那么补阳还五汤是否可以促进血管新生进而抗脑缺血损伤?本研究通过免疫组织化学方法观察脑缺血后血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vWF)的表达,探讨脑缺血是否可以诱发缺血周围区的血管新生,以及补阳还五汤是否可以促进脑缺血大鼠缺血区血管新生,为脑缺血后循环重建和功能恢复提供一个新的思路和方法。 1材料与方法 动物 清洁级SD大鼠100只,体重250～300g,雌雄各半,购于上海实验动物中心。 药物 补阳还五汤处方来源于清王清任《医林改错》,按原方组成:黄芪120g、
3、赤芍10g、川芎10g、当归尾10g、地龙(研末)10g、红花10g、桃仁10g,中药饮片购自湖南省中医研究院,为同一批药材,经鉴定符合2005年《中国药典》的规定。补阳还五汤传统汤剂制备:传统饮片先用清水浸泡30min,第一煎加药材5倍体积水,煎汁30min,二煎5倍体积水,煎汁30min,两煎混合,每毫克含生药g,置于4℃下冷藏备用。 试剂 vWF单克隆抗体、罗丹明红(rhodaminered)、异硫氰酸荧光黄(FITC)均购自美国Sigma公司;BrdU单克隆抗体购自美国Chemico公司;重组人血管内皮抑制素(endo
4、statin,ED)购自湖南中医药大学第一附属医院;SABC试剂盒、AEC显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TTC(2,3,5-triphenyltetrazoliumchoride)、PBS磷酸盐缓冲液(mol/L,Ph值～)均购自武汉博士德生物工程有限公司;水合氯醛、双氧水均购自北京鼎国生物工程有限公司。 仪器 英国Thermo公司E60冰冻切片机;日本Olympus公司BX51光学显微镜及()图像分析系统;上海玻璃仪器一厂自动双重纯水蒸馏器;杭州蓝天化验仪器厂ZD-600电热恒温水浴箱;上海台之衡电子衡器有限公司F
5、A型电子天平。 动物分组与给药方法 90只大鼠造模成功后随机分为模型组、补阳还五汤组、ED组和补阳还五汤+ED组,另设正常对照组、假手术组各5只,假手术组只打开颈部皮肤,暴露颈部血管后不做其它任何处理即缝合。造模成功动物术后分别存活1、7、14天和28天后处死,每组每个时间点各5只。补阳还五汤组动物于术后苏醒2h后起按4mL/kg,灌服补阳还五汤药液,每日1次;ED组动物于术后按mg/kg腹腔注射ED,前3天每天1次,之后每周2次;补阳还五汤加ED组动物同时进行上述两组动物的操作;上述3组按50mg/kg腹腔注射5-嗅脱氧尿嘧
6、啶核苷进行累积标记,前3天每天1次,之后每周2次,动物若死亡则随机补充。其他各组动物均给予等体积无菌蒸馏水,自由饮食、活动。 动物造模 采用文献改良的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型,10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔注射麻醉,固定后颈部正中消毒,然后做一长约～cm的切口,钝性分离出右侧颈总动脉,在其远心端分叉处分离出颈内动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉,然后在颈总动脉分叉处近心端作一小切口,将一段一端钝圆的4-0尼龙线由颈总动脉插入至颈内动脉,感觉到有轻微阻力为止,大约进入mm,然后结扎固定,缝合切口
7、,在切口及周围涂抹抗生素。假手术组仅切开皮肤,分离右侧颈总动脉后即缝合。正常组不做任何特殊处理。手术过程中室温保持在20～30℃并使用加热垫或白炽灯照射。术后将动物放入清洁的饲养盒中,若死亡则随机补充造模。 成功模型标准 行为学改变表现为动物苏醒后提尾时左侧前肢内收屈曲;同侧Horner征(颈交感神经麻痹综合征:瞳孔缩小、眼睑下垂及眼裂狭小、眼球内陷和患侧额部无汗);爬行时向左划圈;站立时左侧倾倒。TTC染色后梗死区域呈白色,位置在皮层下,大脑的一侧,对侧大脑半球正常脑组织则被染成红色。神经功能评分待清醒2h后按文献的五级评分
8、标准进行神经功能评分,0级:行为无明显变化(0分);1级:左前肢屈曲,左后肢伸展(1分);2级:有左侧追尾现象(2分);3级:行走困难,摇摆不定(3分);4级:无自发性活动,有意识障碍(4分)。将第1、2、3级(1～3分)大鼠确定为成功模型分入各组
