《基因工程重点》word版

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1、第一章基因工程的定义：狭义：指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪切重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达新的性状。广义：DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。第二章载体的功能⑴运送外源基因高效转入受体细胞⑵为外源基因提供复制能力或整合能力⑶为外源基因的扩增或表达提供必要的条件一个理想载体应具备四个条件：⑴具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）⑵具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点⑶具有多种单一的核酸内切酶识

2、别切割位点⑷具有合适的筛选标记质粒：是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA。重要的大肠杆菌质粒载体A、质粒pBR322质粒pBR322结构：（1）氨苄青霉素抗性基因。3种限制酶单一识别位点。（2）四环素抗性基因（3）DNA复制起点优点：（1）具有较小的分子量。（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶

3、只含有一个能切割的位点。B、pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数（2）适用于组织化学法检测重组体（3）具有多克隆位点区段质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之

4、间沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体;加溶菌酶裂解细菌细胞壁;沸水浴40秒钟;离心，用无菌牙签挑去沉淀物;乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。质粒DNA纯度底、快速、操作简便各种载体的承载能力：（1）l-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制修饰活性双功能的酶限制酶和修饰酶分开双功能酶内切酶的蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种亚基限制辅助因子ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+和S-

5、腺苷甲硫氨酸ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp位于识别位点上特异性位点3‘端24-26bp处特异性切割不是（随机）是是基因克隆中无用非常有用用处不大II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。同位酶：一部分酶识别相同的

6、序列，但切点不同。同裂酶：识别位点与切割位点均相同来源不同的酶。同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。影响限制性核酸内切酶活性的因素1底物DNA2内切酶的用量3反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L)4反应温度，大多数内切酶的最适温度为37℃DNA连接酶连接的作用机制⑴E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppiE(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN⑵E－AMP＋DNA＝DNA－AMP＋E⑶DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。T4DNA

7、连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。其他工具酶1.Klenow片段酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶IC端的大片段。Klenow片段的主要用途（利用5’→3’的聚合酶活性）⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端⑵标记DNA片段的末端底物用［α－32P］－dNTPs⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成⑷DNA序列的测定2.末端转移酶末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。来源小牛胸腺。在人工黏性末端的构建中极有用处。3、S1核酸酶常用来切平突出的单链末

8、端以及制作S1谱图。4、T4-DNA聚合酶有5-3聚合活性、5-3外切活性及3-5外切活性。用于修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3突出末端。1个标准单位(U)的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲体系中，37℃反应1h完全水解1μgpBR322DNA所需的酶量。一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.01μgDNA5µL、10倍的缓冲液2µL、酶1µL，无菌重蒸水12µL，反应总体积为20µL。1国标单位(U)的T4-DNA连接酶定义为：在最佳缓冲体系中15℃、1h内