dna重组实验中常用的技术

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1、DNA重组实验中常用的技术一、质粒DNA的提取及鉴定　　（一）质粒DNA的提取及鉴定　　1．收获细菌　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。　　2．碱裂解法小量抽提质粒　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmo

2、l/lTris–HClpH8.0,10mmol/LEDTA）中，剧烈振荡。　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/lNaOH,1%SDS），缓和振荡，水浴5min。　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/LKAC60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。　　（

3、7）4℃以12000g离心5min。　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。　　（二）质粒DNA的大量制备　　（1）同上1.（1）　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。　　（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。　　（4）收集菌液于离

4、心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。　　（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。　　（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。　　（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。　　（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。　　（9）15000rpm4℃离心20min。　　（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。　　（11）用5ml1×TE溶解，加入R

5、NaseA15～20μl，42℃水浴4h于过夜。　　（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。　　（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。　　（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。　　（15）加入1/10体积的3mol/lNaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。　　（16）10000rpm4℃离心20min。　　（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。　　（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×

6、TE溶解质粒DNA。　　（三）质粒DNA的鉴定　　1．酶切反应　　（1）在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer1μl，DNA2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。　　（2）取反应物点样，观察酶切效果。　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。　　2．琼脂糖电泳　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。　　（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。　　（3）打开电源开关，5V/cm电泳。　　（4）在UV灯下观察电泳结果。　　二、DNA的重组　　（一）DNA的酶切与

7、连接　　（1）酶切反应　　同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。　　（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/lNaAc混匀，-20℃2h以上。　　（3）15000rpm离心15min，弃上清。　　（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。　　（6）测定DNA的含量。　　（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反

8、应12～16h。　　（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。　　（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。　　（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化　　1．感受态的制备　　（1）接种单菌落于2mlLB培养液中，37℃过夜。　　（2）取0.25ml过夜菌入25mlLB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。　　（3）倒入