实验七dna体外重组技术

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1、实验七DNA体外重组技术一．概念DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。二．基本过程分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。①目的基因的来源：ⅰ。直接分离

2、适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。ⅱ。人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成。ⅲ。由mRNA逆转录合成cDNA细胞总RNA分离mRNA分离目的基因mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA发卡环的消化cDNA的克隆ⅳ。从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库

3、），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。ⅴ。PCR②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：ⅰ.能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增ⅱ.具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiplecloningsites)，便于进行克隆ⅲ.分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制ⅳ.易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、α-互补显色反应（蓝白斑筛选）ⅴ.表达型载体应配

4、备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件ⅵ.生物安全性好目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。

5、实验质粒DNA提取一．原理1．定义独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。2．来源存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。3．分类质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒①严紧型质粒(Stringentcontrol)严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒,如F因子。②松弛型质粒(Relaxedcontr

6、ol)松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。4．构型质粒构型：超螺旋型（SC），开环形（OC），线型（LC）5.碱裂解法提取质粒原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构差异

7、来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。质粒DNA染色体DNA分子量小（1.5kb－15kb或60kb－120kb）大结构超螺旋，共价，闭环线性，双螺旋变性pH>12.6氢键断裂，两条互补链不完全分离双螺旋完全打开

8、复性pH中性恢复原始构象不能复性二．实验试剂溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(最终pH4.8)三．操作步骤1.10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。2.加入100ml溶液1，振荡至彻底悬浮。3.加入200ml溶液2，立