《基因工程试验》word版

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1、基因工程实验流程植物总DNA的提取（作为PCR的模板）质粒的提取与酶切检测（pET28a及pET28a-SRP）PCR产物从琼脂糖凝胶上的回收PCR产物与T载体的连接6月23号6月24号6月25号PCR产物及pET28a双酶切、纯化回收（电泳、凝胶回收）原核表达载体的诱导表达及目的蛋白的检测6月27号6月29号重组载体转化大肠杆菌DH5α阳性克隆检测——菌落PCR6月26号6月28号目的基因的克隆（PCR扩增）PCR双酶切回收产物与pET28a载体的连接（连接后可在4C保存）重组载体转化大肠杆菌M15或DL21重组载体的检测——菌落PCR、双酶切等6月30号-7月2号实验一丹参总DNA的

2、提取实验目的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。实验材料：丹参叶片实验器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头实验步骤：第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。1.取适量植物组织（新鲜组织100mg或干重组织30mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl65℃预热的裂解液PL(确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大

3、口径枪头轻柔吹打帮助裂解。如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。如RNA残留多，可在水浴前加入6μlRNA酶（20mg/ml）。4.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm离心5分钟。若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。

4、6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ（请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放-5-入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。9.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。10.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。11.

5、将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。13.DNA可以存放在2-8℃，如果要

6、长时间存放，可以放置在－20℃。按照植物总DNA提取试剂盒操作说明。1%琼脂糖凝胶电泳检测注意事项：1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。2.开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。3.需要自备氯仿/异戊醇（体积比24：1混合）、无水乙醇和β-巯基乙醇。4.结合液PQ和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。5.不同来源的植物组织材料中提取DNA的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg

7、。6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。实验结果：本组实验结果是第九孔和第十孔，其中第九孔的DNA提取效果较第十孔提取效果好。两空之间的差异可能是由于两个离心管中添加的植物量不一样，所以最后提取的量不一样。实验结果分析：1.在液氮研磨叶片的时候，研磨不够充分，且在向离心管中添加的时候，添加的量不多，速度慢，导