基因克隆技术的研究进展

《基因克隆技术的研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目：基因克隆技术的研究进展作者：王剑学号：201207739指导教师：谢放完成日期：2014-7-16基因克隆技术的研究进展摘要：为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价.这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术.关键词：基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源

2、序列技术;表达序列标签技术克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。　　克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，

3、比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多莉”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序

4、列技术等.1差异表达基因分离技术1.1扣除杂交技术扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD2NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DN

5、A;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的BamHI位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠Y染色体的DNA.该法的缺点是技术要求较高、工作量大,并且有时得出的数据不大可靠.然而经过多年的改进,扣除杂交技术已发展成为众多克隆技术的基础,很多克隆技术都是从此技术衍生发展而来,如抑制性扣除杂交技术.它是先将样本mRNA和参照mRNA分别逆转录成cDNA,用4种碱基识别并酶切两种cDNA以产生平端片段;样本mRNA分布接上接头1和接头2,并与

6、过量的经Rsa1消化的参照样本杂交;在接头处设计引物,使具有差异表达的片段成为PCR扩增的模板,重复杂交以减少非特异性扩增片段,利用接头上的酶切位点进行克隆和测序.1.2差式筛选技术分别从有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样中提取mRNA经逆转录形成cDNA,并构建有特异性表达基因的目标样的cD2NA文库,再分别用有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样的cDNA探针与有特异性表达基因的目标样cDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交,选出只与有特异性表达基因的目标样杂交的克隆,即为有特异性表

7、达基因的目标样特异表达的克隆.此技术要经过多轮菌斑杂交,不仅费力费钱,重复性差,而且灵敏度低.1.3差异显示PCR差异显示PCR[2]是1992年由Liang报道的.此法的主要原理是由mRNA2PCR共同组成的,利用大多数真核细胞基因的mRNA结尾处有poly(A)结构,在其3′端设计5′poly(T)引物,该引物可与mRNA结合,从而使这部分的基因达到转录.然后从两种不同类型的细胞中分离mRNA,作反转录,比较PCR产物后即可克隆目的基因.其具体操作为:用一套锚定引物反转录每一部分材料后,再分别用这一套锚定引

8、物和随机引物从反转录的每一部分材料中扩增cDNA,电泳分离产生扩增片段后再扩增两种不同状态下有差异的片段,并且进行克隆和测序.如果采用同位素标记的方法,在凝胶电泳或放射自显影照片上就可发现不同长度的扩增产物.该技术能快速地显示细胞mRNA的组成,可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示,并且所用mRNA量少;可以立即对扩增的cDNA进行测序和克隆及与探针标记、杂交和文库筛选.它的缺点