《余功臣分子克隆》word版

《《余功臣分子克隆》word版》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、分子克隆技术实验报告应用生物技术08012008304201308余功臣2011年5月22日说明实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见《分子克隆技术实验手册》附录。一．将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上摘要运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片段M812的质粒p

2、U1301，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA的质量，用限制性内切酶BamI和KpnI处理pU1301和pUC19，将纯化的载体pUC19与回收的水稻DNA片段M812连接后，将重组的DNA分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a并在培养皿上培养。关键词碱裂法琼脂糖凝胶电泳检测亚克隆感受态细胞重组子的转化1前言亚克隆，即是将已经获得的目的片段进行进一步分析，或者进行重组改造等过程。其基本过程包括：（1）目的片段和载体的制备；（2）目的片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。本实验中的目的片段

3、和载体均来自细菌质粒，因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法，是1979年由Birnboim和Doly设计并发表的经典质粒DNA提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体会沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的

4、差异。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带，因为质粒有三种构型，即线状、环状、开环状。将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组，其包括载体及外源DNA片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。将重组DNA导入

5、大肠杆菌细胞一般有两种方法——CaCl2法和电转化法，本实验中采用CaCl2法。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/mgDNA。2材料和方法2.1用碱裂解法抽提质粒2.1.1实验材料2.1.1.1菌液携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。2.1.1.2培养基携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的

6、大肠杆菌的培养先采用含相应抗生素的LA培养基，后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37℃培养。抗生素的使用浓度：氨苄青霉素，100µg/ml；卡那霉素，50µg/ml。2.1.1.3实验试剂SolutionI;SolutionII;SolutionIII;苯酚/氯仿;异丙醇;ddH2O22.1.2两种载体的抽提步骤1.取含有所需载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养；2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37℃摇床

7、~250r/min过夜培养；3.吸取1.5ml菌液，12000r/min离心1分钟，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次12000r/min离心1分钟收集菌体，尽量将菌液倒干净；4.加入300ml溶液I，振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5.加入300ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）；6.加入300ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；7.12000g离心10分钟；8.吸取800ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）

8、至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；9.12000g常温离心15分钟；10.倒尽上清，加500ml75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）11.加40ml灭菌超纯水溶解；12.质粒的质量检测，-20℃保存。2.1.3DNA的琼脂糖凝胶电泳步骤1.将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；2.称取0.24g