辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书（50T）.doc

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1、SolarbioShanghaiSolarbioScience&TechnologyCo.,LtdTel:021-54100800Fax:021-54261506Http://www.shsolarbio.com辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书（50T）一、测定意义：NAD是糖酵解和TCA循环的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD比值的高低可用于评价糖酵解和TCA

2、循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD降解产物具有非常重要的调控作用。二、测定原理：NAD和NADH在254nm下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。三、试验中需自备的仪器和试剂：高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各2个，0.45μm）、C18柱（4.6×150mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、乙腈（120mL）、甲醇（色谱级，300mL

3、）、蒸馏水注：若用自动进样器，需要样品瓶，测定时将不少于1mL的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样器，需手动进样时，不需要样品瓶，用进样针将不少于20ul的样品或标准品打入进样阀。四、试剂的组成和配制：试剂一：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，形成NAD和NADH提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存3个月；试剂二：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，粉剂3×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂2和粉剂3溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形

4、成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）,4℃保存3个月。试剂三：NAD标准品5mg×1支，-20℃保存。加入1mL试剂一，配成5mg/mL溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。试剂四：NADH标准品5mg×1支，-20℃保存。加入1mL试剂一，配成5mg/mL溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。五、实验前的准备工作：1.将双蒸水1000mL、流动相缓冲液基质1000mL、甲醇300mL和乙腈120mL用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。2.流

5、动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000mL与乙腈配比为9：1（v/v），即取900mL缓冲液基质与100mL乙腈混合。[每个样品需要约12mL流动相，流动相用量（mL）=12mL×样品数量+跑基线用量（约50mL），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。3.将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，双蒸水各250mL。4.将2和3中的溶剂超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。六、辅酶ⅠNAD(H)的提取：组织的处理：准确称取组织重量，按重量体积比（g/mL）加9倍试剂一，提取NAD和NADH，制成10%匀浆。

6、20000g/min离心30min，取上清液用0.22μm水系针头式过滤器过滤后待测，同时测定组织蛋白含量。细胞处理：收集于60mL细胞，离心菌体经高压冷冻干燥12h后，加入2mL试剂一。超声破壁细胞(950W，30%，15min，工作1s，间隔2s)，再经10,000r4℃高速离心40s，上清用0.22μm水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。七、辅酶ⅠNAD(H)含量测定操作步骤：1.开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开empower软件，在方法组中设置进样量20μL，流速0.8mL/min，保留时间15min，检测波长254nm,设置完毕保存方法组

7、。2.用100%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。3.用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。4.加入标准品20μL，在15min内可分离NAD和NADH，NAD的保留时间在3min左右，NADH的保留时间在7min左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的NAD和NADH标准品的峰面积。5.加入样品20μL，在相应保留时间处检测NAD和NADH的峰面积。八、辅酶ⅠNAD(H)含量的计算：1.NAD含量的计算NAD标准曲线的绘制：将5mg/ml的NAD标准品用双蒸水分别稀释成110μg/ml、80μg/ml、5

8、0μg/ml、和20μg/ml的NAD标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。计算标准曲线公式