辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒使用说明

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1、http://www.solarbio.com辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒使用说明货号:BC0315规格:100管/48样产品内容:酸性提取液:50mL×1瓶,4℃保存;碱性提取液:50mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体10mL×1瓶,4℃保存;试剂二:液体3mL×1瓶,4℃保存试剂三:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入3mL双蒸水,混匀,4℃保存一周;试剂四:粉剂×1支,4℃保存,用时加入3mL双蒸水,混匀,4℃保存一周;试剂五:液体3.6mL×1支,4℃保存;试剂六:液体30mL×1瓶,4℃保存

2、;试剂七:液体50mL×1瓶,4℃保存。操作步骤:+一、NAD和NADH的提取:1、血清(浆)中NAD+和NADH的提取:+NAD的提取:取0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液,煮沸5min(盖紧);冰浴冷却后,10000g4℃离心10min;取上清加入等体积碱性提取液;混匀,10000g4℃离心10min,取上清,冰上保存待测。NADH的提取:取0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液,煮沸5min,冰浴中冷却后,10000g4℃离心10min,取上清加入等体积酸性提取液;混匀,10000g4

3、℃离心10min,取上清,冰上保存待测。http://www.solarbio.com+2、组织中NAD和NADH的提取:+NAD的提取:称取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液,冰浴研磨,煮沸5min(盖紧),冰浴冷却后,10000g4℃离心10min,取上清加入等体积碱性提取液混匀,10000g4℃离心10min,取上清,冰上保存待测。NADH的提取:称取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液,冰浴研磨,煮沸5min(盖紧),冰浴冷却后,10000g4℃离心10min,取上清加入等体积酸性提取液混匀,

4、10000g4℃离心10min,取上清,冰上保存待测。3、细胞或3、细菌中NAD+和NADH的提取:+NAD的提取:收集500万细胞或细菌,加入1mL酸性提取液,超声波破碎1min(强度20%或200W,超声2s,停1s),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g4℃离心10min,取上清液至另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,冰上保存待测。NADH的提取:收集500万细胞或细菌,加入1mL碱性提取液,超声波破碎1min(强度20%或200W,超声2s,停1s

5、),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g4℃离心10min,取上清液至另一新的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,冰上保存待测。二、测定步骤(在1.5mLEP管中按下表依次加样):试剂名称对照管(μL)测定管(μL)样本2020试剂一8080试剂二3030试剂三3030http://www.solarbio.com试剂四3030试剂五3030200充分混匀,室温避光静置20min后再加试剂六200充分混匀,静置5min后,20000g,4℃离心5min,弃上清,沉

6、淀中加入:试剂七400400混匀,取200ul至比色皿或酶标板中,570nm下比色,读取吸光值A=A测定管-A对照管。注意事项1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加,必须分开加。2、对照管加入试剂五后必须加上加试剂六;测定管加完试剂五后要反应20min才能加试剂六。+3、由于每个测定管需要设置一个对照管,本试剂盒100管可测48个NAD和NADHNAD+含量的计算1、血清(浆)中NADH含量计算+NAD含量(nmol/mL)=[(A-0.099)×36.1×V1]÷(V3×V1÷V2)=

7、722×(A-0.099)2、组织、细菌、细胞中NAD+含量计算+(1)按样本蛋白浓度计算NAD(nmol/mgprot)=[(A-0.099)×36.1×V1]÷(V1×Cpr)=36.1×(A-0.099)÷Cpr+(2)按样本鲜重计算NAD(nmol/mgmass)=[(A-0.099)×36.1×V1]÷(W×V1÷V2)=72.2×(A-0.099)÷Whttp://www.solarbio.com+4(3)按细菌或细胞密度计算NAD(nmol/10cell)=(A-0.099)×36.1÷(

8、500×V1÷V2)=0.1444×(A-0.099)NADH含量的计算1、血清(浆)中NADH含量计算NADH含量(nmol/mL)=[(A-0.065)×24.7×V1]÷(V3×V1÷V2)=494×(A-0.065)2、组织中NADH含量计算(1)按样本蛋白浓度计算NADH(nmol/mgprot)=[(A-0.065)×24.7×V1]÷(V1×Cpr)=24.7×(A-0.065)÷Cpr(2)按样本鲜重计算NADH(nmol/

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