型重组腺相关病毒(raav6)高效并优先感染星形胶质细胞的体内外研究

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1、六型重组腺相关病毒（rAAV6）高效并优先感染星形胶质细胞的体内外研究摘要：       腺相关病毒载体是越来越受欢迎的载体工具，它可将基因输送到中枢神经系统，具有非致病性、免疫原性低、可感染分裂细胞和非分裂细胞的特点。它的一个局限性是对神经类细胞的感染有取向性，神经胶质细胞特别是星形胶质细胞的感染效率很低。为了克服这个局限，先前的研究中利用星形胶质细胞的特异性的启动子来构建载体包装病毒，以及用不同血清型的病毒来感染星形胶质细胞，但是各种研究中的感染效率并不一致。在本实验中，我们测试了7种商业化的腺相关病毒

2、的血清型，血清型1、2、5、6、7、8、9（腺相关病毒由维真生物提供），通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达来测试各种血清型病毒感染星形胶质细胞的能力。在细胞培养中，rAAV6表现出稳定的高效的感染效率，而rAAV2只有一些批次的病毒对星形胶质细胞有感染性。为了证明我们所用的病毒活性没有问题，我们将所用病毒感染公认的易感染细胞ARPE-19细胞并都表现出很高的感染性。基于体外实验结果，我们选用rAAV6和rAAV2进行了体内实验，同样条件下感染星形胶质细胞和神经元细胞，感染3个星期后，对病毒表达蛋白GFP、

3、神经元细胞特异性标志蛋白NeuN以及星形胶质细胞特异性标志蛋白GFAP进行免疫染色，我们发现rAAV6对星形胶质细胞有很高的感染率（90%以上细胞被感染），但是对神经元细胞的感染率很低（约10%感染率），相反地，rAAV2对神经元细胞有高感染率（约65%），但是不易感染星形胶质细胞（约20%）。总之，我们的研究表明rAAV6能够被用作对体内星形胶质细胞进行基因表达调控（过表达或敲低）的工具。 前言    病毒载体在中枢神经系统中广泛用于基因递送和目的基因的表达。其中，腺相关病毒（AAV）已越来越受欢迎，它具

4、有以下优势：非致病性，低免疫性，能有效转导分裂细胞和非分裂细胞，并能产生持久的基因表达。 AAV载体在基础研究中的成功使其应用于临床实践中，包括在中枢神经系统中的应用。在过去的十年来，重组AAV已经应用于脑组织，脊髓和视网膜的临床试验中。rAAV在基因治疗中的安全性也越来越有吸引力，那些在中枢神经系统中的实验，以及几种人类单基因疾病的表型校正实验说明了rAAV应用的安全性，这也进一步提高了rAAVs在基础研究中的利用价值。    腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链 DNA 病毒，是细小病毒家族的一员，通

5、常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能进行自我复制。简单的AAV基因组有两个反向末端重复区（ITR），其中间有约4.7kb的线性单链DNA的开放阅读框。 rep部分基因组负责编码病毒复制和基因组特异性位点整合的四种蛋白质；另外的cap开放阅读框负责生成三种不同的衣壳蛋白。在应用于基础研究和临床实践中的重组AAVs，rep和cap基因被删除，取而代之的是目的基因序列或shRNA序列，抗生素筛选标记等基因序列。因此，重组包装AAV需要额外的编码rep基因的质粒（通常衍生自AAV2）和编码cap基因的质粒，

6、以及提供腺病毒辅助基因的辅助质粒，cap基因可来自于各种血清型或进行过基因改造的衣壳蛋白基因）。   AAV衣壳蛋白的不同决定了它们在依据细胞类型和组织嗜性方面的血清型之间的差异。原型AAV2与硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合从而接近靶细胞，并与靶细胞的共同受体相互作用，例如整合素αVβ5，αVβ1，肝细胞生长因子和层粘连蛋白。有助于其他血清型AAV感染的细胞表面受体的研究的较少，普遍认可的有唾液酸或半乳糖的蛋白多糖。最近的一篇文章发现了孤儿跨膜蛋白KIAA0319L可作为几种常见的AAV血清型的受体，包括AAV6

7、，这将有助于我们进一步理解细胞机制（Pillayetal.,2016）。   星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、功能最复杂的细胞，它对正常大脑功能和许多神经障碍方面有非常重要的作用。随着人们对正常和病理细胞研究兴趣的增长，对能够有效靶向星形胶质细胞的病毒载体的需求不断增长。但是，过去大多数的研究都集中在rAAV对神经元细胞的感染上。最常用的血清型rAAV2，几乎对所有啮齿动物和非人类灵长类动物中的神经元细胞都有应用研究。rAAV1,5,8和9也有相同模式的报道（Burgeretal.,2004;Cear

8、leyandWolfe,    2006;Dodiyaetal.,2010;Markakisetal.,2010）。相比之下，其他文章还报道了rAAV1,5,8和9对星形胶质细胞有一定的偏好性（Davidsonetal.,2000;Foustetal.,2009;Grayetal.,2011;Aschaueretal.,2013;Petrosyanetal.,2014;Watakabeetal.,2015），甚至