离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定

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1、离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定【摘要】目的探索新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培养与传代及纯化方法，鉴定其培养纯度。方法分离、培养新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进行免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。结果星形胶质细胞贴壁快，多在12h内，3d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，NF200抗体染色为阴性，提示培养盖片中不含神经元；GFAP阳性染色细胞高达95.8%。结论换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化得到高纯度的星形胶质细胞，是一种简单、高效的星形胶质细

2、胞纯化方法。【关键词】星形胶质细胞；神经微丝蛋白；胶质纤维酸性蛋白PurificationandidentificationofastrocyteofspinalcordinvitroAbstract:ObjectiveToexplorethemethodofisolation,culture,andpurificationofastrocytederivedfromspinalcordofneonaterats,andidentifiedbyimmunocytochemicalstain.MethodsA

3、strocytederivedfromspinalcordofneonateratseediumandrotation.Passagethroughenzymedigestionandidentifiedbyimmunocytochemicalstain,tocountthepuritycoefficientofastrocyte.ResultsAstrocytesadheredafterplated12h,thenumbersincreasedsignificantlyafter3d.Immunocyto

4、chemicalstainshoeediumandrotation,soitisasimpleandhigheffectivemethodforthepurificationofastrocyte.Keyent;glialfibrillaryacidicprotEin近年，神经胶质细胞（astrocyte，AST）已成为神经科学研究的热点之一［1］，它不仅具有支持、分隔、营养和保护神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突触形成中起着重要作用［2-3］。AST的分离、培养方法报道较多，取材部位以大脑皮

5、层为主，脊髓相对较少，纯化方法常以多次传代为主。因此，有必要对星形胶质细胞的分离、培养与传代和纯化进行系统的研究，并对其培养纯度进行鉴定。1材料与方法1.1试剂与仪器DMEM培养基、D-Hank液和胎牛血清（FBS）皆购自Gibco公司，L-谷氨酰胺、Hoechst、胰蛋白酶和小鼠抗神经微丝单克隆抗体（NF200抗体）购自Sigma公司，兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗小鼠-IgG和抗体稀释液皆购自北京中杉金桥生物技术有限公司。显微镜型号为OlympusBX

6、-60，荧光激发装置为OlympusMODELBH2-RFL-T3，CO2培养箱THERMOFORMA3111。1.2细胞的分离和培养取新生24h内Sprague-Daim，用含血清培养基终止消化，过200目筛网，1100r/min离心5min，弃上清，加入DMEM培养基(含10％FBS)，轻柔吹打，制成细胞悬液，调节细胞密度为1×106/mL，接种在25cm2培养瓶中，置37℃二氧化碳孵箱，每3d半量换液1次。1.3AST的纯化每次换液都要将培养液吸干，使细胞在空气中暴露10秒钟以杀死少突胶质细胞；待细胞

7、基本铺满培养瓶后，在37℃、280r/min摇18h，倒去培养液并用新鲜培养液漂洗3次，将所得纯化星形胶质细胞用二次酶消化法传代，用含血清（10%）培养液将细胞密度调至1×106/mL，种植到培养皿中的盖玻片上（用作免疫组化鉴定）和培养瓶内，每3d半量换全培养液1次，直至细胞融合。1.4AST的鉴定对培养的AST作免疫细胞化学染色鉴定，GFAP与NF200抗体作免疫荧光双标，并用Hoechst染核标识细胞总数，计数AST的纯度。简言之，培养盖片经PBS漂洗2次，4℃丙酮室温固定10min，PBS漂洗5min

8、×4次，加NF200抗体（1∶1000）50μl/盖片，37℃湿盒孵育1h后4℃冰箱过夜，PBS漂洗5min×3次，TRITC标记山羊抗小鼠-IgG（1∶400）37℃孵育1.5h，PBS漂洗5min×3次，加GFAP抗体（1∶500），以等量的抗体稀释液作为对照，37℃湿盒孵育4h后PBS漂洗5min×3次，FITC标记山羊抗兔IgG（1∶400）37℃湿盒孵育1h后Hoechst（终浓度为1μg/mL）染细胞