隆线溞孤雌溞cdna文库的构建及chemonsensory基因的研究

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1、途鱼遣硕士学位论文答辩委员会成员名单姓姓名名职称称单位位备注注李李利珍珍教授授上海师范大学学主席席王王群群教授授华东师范大学学学唐唐思贤贤高级工程师师华东师范大学摘要摘要枝角类又称水蚤，是一类在淡水中普遍存在的小型浮游动物，隶属于节肢动物门，甲壳纲。是鱼类和无脊椎动物的开口饵料，在水生态系统中有重要的作用;同时由于它们能够指示环境中的有毒物质，并具有易于培养、生活周期短等特点，因此被广泛地应用于形态学，种群生态学，种质遗传学，环境评估及毒理学等研究领域。水蚤的生殖方式十分特殊，它们具有两种生殖模式。当环境条件适宜的时候，以孤雌生殖(卵子不经受精而直接发育成子代的生

2、殖方式)为主，然而当受到诸如温度改变，食物匾乏，种群密度过大等环境胁迫因素时，生殖方式即会转为两性生殖。因此，由于其性别决定和环境可诱导性别转化的特殊性，使蚤类成为生殖转化研究的良好模式动物。但大多研究集中于环境因子对生殖影响方面，从分子生物学角度探讨生殖发育规律十分有限。表达序列标签(包含在cDNA文库中的序列)分析技术是一项在组织细胞中能够有效鉴别新基因和测量基因表达谱的方法。目前已经广泛的应用于新基因的发现、基因组物理图谱的构建、基因组中基因的预测、转录模式的确定、单核普酸多态性的发现和分子标一记的建立等研究中。本文以淡水水域常见种一隆线搔【及沪力nz’a亩

3、ten口‘却力刀丁a)caI’jnata]孤雌搔成体为研究对象，运用分子生物学技术构建其cDNA文库，采用生物信息学手段对文库数据进行分析并构建基因表达谱。从文库中筛选出功能注释为Chem0Sensory蛋白的片段，通过分子生物学实验获得其部分序列。运用分子生物学、毒理学以及透射电镜等技术在不同环境条件刺激下，分析该蛋白表达差异和对隆线搔生长和生殖的影响。旨在探索枝角类生殖转化的规律和分子基础，拓展和丰富甲壳动物发育生物学的研究内容，促进枝角类生殖生物学研究的深入和发展，同时为实现枝角类生殖转化的人为调控奠定基础。本论文主要研究结果与结论如下:1.隆线搔孤雌搔cD

4、NA文库的构建、EST序列分析以及与大型搔基因组数据库的比对研究首次构建了隆线搔孤雌搔成体的cDNA文库，并从中随机选取3072个克隆进行测序，最终得到3040个ESTs，平均长度571如。去除载体和低质量序列后得到2997个高质量EsT序列(oe宜Bankaeeessionno.:on269049-摘要on272045)，平均长度为617bp。2997个序列经拼接聚类后得到了465条eontigs和1030条singletons，因此最终得到的uniquesequenees为1495条。通过BLASTX和BLASTN程序分别与非冗余蛋白和核酸数据库进行序列同源性

5、比对。E一value低于1.0火10一，认为序列显著性同源。有959条uniquesequenees(64%)与已知基因有较高同源性。经功能注释与分类后，发现了一些与水搔生殖发育以及环境感应相关的新基因。该文库与报道的大型搔全基因组数据库比较，结果显示，1495个丽quesequenees中有1283条(86%)序列与大型搔基因组序列可匹配成功。2.不同环境因子对隆线搔生长和生殖的影响以及Chemonsensory基因的表达差异通过环境因子诱导，观测分析隆线搔各相关生理生化指标的变化，探讨环境因子对隆线搔生殖转化的的影响以及环境感应蛋白在其应激过程中表达量的变化及

6、作用。2.1环境因子对隆线搔生长发育和生殖的影响通过单因子梯度试验方法，研究了添加不同浓度CdC12(0.32，0.56，2.00，2.80，3.20，5.60，10.00，18.00，32.00pg/L)以及改变温度(高温32℃，低温6℃)对隆线搔体长、第一次怀卵日、怀卵数的影响以及CdCI:对隆线搔肠壁超微结构的损伤。温度及重金属离子对隆线搔的生殖发育都有较大影响:Cd“对隆线搔24h，48h，72h，96h的LCS。分别为1800，560，282，132.1pg/L。9个安全浓度处理隆线搔一个生殖周期后，在Cd2+的干扰下，与对照组相比，隆线搔在低浓度下体长

7、有所增加，在较高浓度下，体长表现出明显的下降趋势;CdZ+使其怀卵日提前，皆有早熟趋势。怀卵数在低浓度下变化不大，高浓度下急剧减少，但孵化率受其影响不明显。隆线搔肠壁细胞超微结构的损伤程度随着福浓度的升高而明显加剧。与对照组相比，高温对隆线搔的生长无明显促进作用，但会提早性成熟时间;低温不但会抑制其生长，对生殖也有抑制作用，且低温对其生长发育的影响强于高温。本研究结果可为渔业水质标准和工业废水排放标准制定提供理论支持，同时可为水生动物生态毒理学的研究积累基础资料。2.2不同环境因子影响下Chemonsensory基因的表达的差异环境感应蛋白属于一类保守的蛋白家族，

8、对环境因子