龙眼LFYFLO同源基因片段的分离及花芽cDNA文库的构建

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1、中山大学硕士学位论文龙眼LFY/FLO同源基因片段的分离及花芽cDNA文库的构建姓名：郑丽霞申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：黄上志2003.6.10郑丽霞龙眼LFY／FLO同源基因片段的分离及花芽eDNA文库的构建中山大学硕士学位论文2003摘要、＼(龙眼(Euphorialongan(Lour．)Steud．)是我国南方重要的经济果树。成花和结实是目前龙眼生产上的突出问题。而作为研究材料的龙眼新品系四季蜜龙眼则具有易成花的特性，因此从分子水平研究它的成花机理具有十分重要的意义。拟南芥的LEA

2、FY(LFY)和金鱼草的FLORICAULA(FLO)是花分生组织的特征基因，它们控制着花序分生组织向花分生组织的转变。本研究通过分离龙眼中LFY／FLO的同源基因，为今后进行龙眼成花及调控研究奠定基础。户7本研究对RNA提取方法进行改良，首次报告从富含多酚、多糖、原花色素等次生代谢物的龙眼组织细胞中提取了高质量的RNA，保证了后面cDNA克隆工作的顺利展开。根据不同植物LFY／FLO同源基因3’端序列的高度保守性，设计合成简并引物。运用RT—PCR技术。以龙眼花芽RNA反转录得到的sscDNA为模板

3、扩增出一条408bp的LFY／FLO同源片段，将其命名为LGFY。测序结果分析表明，LGFY与拟南芥的LFY和金鱼草的FLO基因相比，其核苷酸同源性分别为76．2％和98．8％。为克隆龙眼中LFY／FLO同源基因的全长序列，以花芽为材料构建了龙眼成花初期的cDNA文库。扩增前文库的滴度为5．6xl06pfu／ml，共约有夸207×106个独立克隆数，重组率达到了99．3％。扩增后文库的滴度为3,412x109pfu／ml，共有160m[，足以供多次大规模筛选。关键词：龙眼花芽LFY／FLO同源基因cD

4、NA文库塑里壅垄垦!!!璺!旦塑查璺苎墨塑坌苎垦垄苎!!坠查生竺苎壅主当查兰堡主堂竺垒查!!!!一ABSTRACTLongan(Euphol。ialongan(Lour．)Steud．)isoneofthemostcommerciallyvaluablefruittreesinSouthChina．Floweringandfructificationaretwosevereproblemswhichinfluencelonganyield．SUimi，anewlineoflonganiseasytof

5、loweringaroundtheyeanSoitisasuitablematerialforstudyingtheIonganflowering．ThehomologousgenesFLORICAULA(FLO)ofAntirrhinum聊c咖盯andLEAFY(．已Fy)ofArabidopsisthalianagovernanearlycontrolpointinthespecificationoffloralmeristemdeterminacy．Theyarecalledflower—mer

6、istem‘identitygenes．ToclonethehomologousgeneinIonganisaverymeaningfitlthing．InordertoextracthighqualityRNAfromlongantissueswhicharerichinphenoliccompounds，polysacchridesandotherunidentifiedsecondarymetabolites，mucheffortwasbeendirectedtowardintegratingm

7、anyRNAextractingmethods．AndaoptimizedonewasdevelopedwhichwasprovedtobesuitableforisolationoftotalRNAfromdifferenttissuesofIongansuchastheflora】bud．inflorescenceandflower．Apairofdegenerateprimerwasdesignedaccordingtothehighlyconservedregionsatthe3’termin

8、usofLFYgeneandit'shomologues．TotalRNAisolatedfromfloralbudwasreversetranscribedandthesinglestrandeDNAwasusedasatemplateforRT—PCR．A408bpfragmentcalledLGFYwasobtainedandthenwassubclonedtoPMDl8一Tvector．SequenceanalysisrevealedLGFYis