草鱼cdna文库的构建及cc趋化因子基因的特征分析

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1、上海海洋大学硕士学位论文草鱼cDNA文库的构建及CC趋化因子基因的特征分析姓名：杨琳琳申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：鲍宝龙20090510上海海洋大学硕士学位论文草鱼cDNA文库的构建及CC趋化因子基因的特征分析摘要cc趋化因子(ccChcmokine)是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族，是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。趋化因子也是当今国际鱼类分子免疫学研究的热点之一。趋化因子的研究将有助于更好地了解鱼类抗病性与天然免疫性的关系。本文以草鱼为研究对象，通过构建草鱼cDNA文

2、库，在草鱼肠道和鳃cDNA文库中筛选到2个草鱼CC趋化因子基因，将其命名为CCL24和CCL5，并对这两个基因在草鱼各组织中的表达情况进行分析，为了解草鱼的先天免疫系统奠定了一定的基础。采用饱和杂交法成功构建了草鱼肠道、鳃和肝胰脏的均一化cDNA文库。随机测序得到7374个EST序列，去除插入片段小于100bp和空载体得到6370个序列。4964个非重复的基因序列中，2781个为GenBank已知的基因序列，2183个是未知的新基因序列。2781个己知基因序列中，没有冗余的有2105个．占基因总数的74．69％，2～5倍冗余的有646

3、个基因，约占总数的23．23％，大于5倍冗余的基因数目为30个，占总数的1．08％。4964个不同基因中551个存在微卫星序列，261个为已知基因序列，290个为未知的新基因序列。这些研究结果，为积累草鱼遗传方面的基础信息，了解草鱼肠道、鳃和肝胰脏组织的基因表达提供了较好的研究基础。在草鱼肠道和鳃的cDNA文库中各筛选到一个CC趋化因子基因，GenBank比对结果显示，肠道中筛选的与斑马鱼CCL24基因相似性最高(76％)，将其命名为草鱼CC趋化因子CCL24；鳃中筛选的与斑马鱼CCL5基因相似性最高(77％)，将其命名为草鱼CC趋化

4、因子CCL5。草鱼CCL24基因cDNA全长为1059bp，编码95个氨基酸；草鱼CCL5基因cDNA全长为895bp，编码119个氨基酸。用生物信息学的方法分别对上述的2个CC趋化因子基因分析。CCL24蛋白分子量为10370．399Da，等电点为8．39；CCL5分子量为13320．981D如等电点为9．155。CCL24和CCL5在氨基端都存在大量的疏水性残基，而羧基末端则有较多的亲水性残基，二者的抗原决定簇分析结果显示CCL24与CCL5均具有很强的抗原性。CCL24和CCL5在2个相邻的半胱氨酸残基之前均具信号肽，CCL24

5、最大可能的信号肽剪切l上海海洋大学硕：}：学位论文位点位于第22位与第23位氨基酸残基之间(TDA．VA)，CCL5最大可能的信号肽剪切位点位于第27位与第28位氨基酸残基之间(AEA．QA)。CCL24与CCL5均具膜内侧向膜外侧和膜外侧向膜内侧的跨膜结构各一个。CCL5具有典型的Smallcytokines(intercl·ine／chemokine)C．Csubfamily结构域。CCL24和CCL5编码蛋白二级结构均以Q螺旋和随机卷曲为主，间或有B转角。通过分析CCL24和CCL5与斑点叉尾鲴CC趋化因子家族进化关系，发现CC

6、L24与SCYAl12同源性最高，CCL5与SCYAl06同源性最高。利用半定量RT-PCR检测CCL24和CCL5在草鱼精巢、头肾、肾脏、肝胰脏、肠道、肌肉和皮肤等不同组织中的表达，发现CCL24基因仅在肾脏和肠道中有表达，且肾脏的表达量要高于肠道；CCL5在草鱼精巢、头肾、肾脏、肝胰脏、肠道、肌肉、皮肤等组织均有表达，。肾脏的表达最高，头肾次之，在肝胰脏和精巢中的表达量最低。草鱼CC趋化因子基冈CCL24存在可变剪接现象。CCL24基冈开放阅读框由四个外显子和三个内含子组成，正常剪接的转录本编码95个氨基酸的CC趋化因子，而另一个

7、转录本保留了第一个内含予，导致密码子移位，终止密码子提前，编码仅为24个氨基酸的短肽。CCL24可变剪接的组织表达分析显示，肠道和肾脏中存在2个转录本，而精巢、头肾、皮肤、肝胰脏和肌肉中仅有未剪切内含子的转录本存在。总之，本研究构建了草鱼肠道、鳃和肝胰脏的均一化eDNA文库，得到了大量的EST序列，并首次得到2个草鱼CC趋化因子基因，对草鱼CC趋化因子基因的组织表达谱分析和可变剪接分析，为后续研究草鱼CC趋化因子的功能和调控以及其抗感染免疫响应模式具有重要意义。剪接关键词：草鱼，cDNA文库，表达序列标签，CC趋化因子，基因表达，可变

8、H上海海洋大学硕士学位论文ConstructionofeDNALibraryofGrassCarp(Ctenopharyngodonideilus)andCharacterizationofCCChemokineGene