解淀粉芽胞杆菌bacillus amyloliquefaciens t27甘露聚糖酶的发酵及酶学性质研究

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1、华中农业大学201l届硕士研究生学位论文摘要肛甘露聚糖酶(p．1，4-D．mannanmannohydrolasc，E．C3．2．1．78)特异性地水解甘露聚糖类半纤维素，产生大量的甘露寡糖和少量的甘露糖。该酶广泛的存在于植物，动物，微生物中，应用于食品工业、造纸工业、纺织工业和饲料工业中。由于工业生产要求所使用的酶具有较强的稳定性、耐热性，乃至耐酸碱等特性，人们将目光投向高压、高温和特殊pH等极端环境的微生物，以寻求新型酶资源。从海洋微生物中筛选特殊性质的p甘露聚糖酶的菌株，是开发甘露聚糖酶的一个新方向。本研究从海泥中筛选

2、出一株高活性甘露聚糖酶产生菌，16sDNA序列分析表明。该序列与解淀粉芽胞杆菌的16srDNA序列同源性为100％，将该菌株命名为BacillusamyloliquefaciensT27。对该菌株产酶条件进行了优化，发现以魔芋粉为碳源，酵母粉为氮源，装液量为50ml，摇速为250rpm，在37"C，培养24小时的条件下，显示出最佳产酶活性，发酵液中粗酶活达到98U／ml。为了进一步研究该菌株甘露聚糖酶的酶学性质，根据芽胞杆菌甘露聚糖酶基因序列设计引物，扩增获得了BacillusamyloliquefaciensT27的甘露聚

3、糖酶基因。测序结果表明，该基因全长los3bp，编码360个氨基酸，将其命名为Man27T。同源分析结果显示，该基因与芽胞杆菌的甘露聚糖酶同源性最高，属糖苷水解酶家族26。将该酶基因Man27T插入大肠杆菌表达载体pGEX-6p-I上，转化大肠杆菌E．coli(BL21)DE3进行表达，并对重组酶的酶学性质进行了分析r重组酶在pH-7．0，40"(2条件显示出最高活性，80℃条件下活性仍保持60％以上．在pH4．0-10．0条件下，处理1h活性基本不改变，表明该酶有较宽的pH稳定性。这些特性奠定了进一步研发应用该酶的基础。关

4、键词：解淀粉芽孢杆菌甘露聚糖甘露聚糖酶克隆高活性高温活性解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens力7甘露聚糖酶的发酵及酶学性质研究Abstract肛ma．nanasehydrolyzesmannanspecially，．beratingmaunan-olignsaccharidesandmannosc．Itwidemyspreadsamongplants，animalandmicroorganism，whichshowsextensivepurposeinthefoodindustry,paperin

5、dustry，fabricindustryandfeedadditiveindustry．Asindustrialprocessoftendemandtheenzymetobeofhighstability，thermostablity，andevenalkalineoracidstabmty，researchershavefocusedontheextremeenvironments，such蹈high-pressure，hi，ghtemperature,andextremepHenvironments，tofindext

6、remophileswhichmayproduceenzyme、)l，itllspecialproperties．Screeningofmalinemicroorganismswithp咱蚴珊擒撒producingabilityfromthespecialnatureisanewtrendtominenovelmannanasc．Inthisresearchtonemeswainthatshowsremarlmblely=．-----degradinga：biltyisscreenedfrom∞amud．16srDNAseq

7、uenceofthisstrainisdeterminedtobeof100％identitytospeciesBacillusamyloliq『uefaciens，andthusthestrinisdesignatedBacillusamyloliquefaciens他7．OptimizationofenzymeproductionusingdifferentparametersfoundthatusmgkonjacflourascarbonSOurce，yeastextractasnitrogenSOurce，at37℃

8、，50ndmediumvolume，250rpm，24hours,Bacillusamyloliquefaciens他7poducesthebestenzymeactivity，、Ⅳimactivityof98U／mlinthecrudefermentationbroth．Tofuller