丙酮酸乙酯对thp-1源性泡沫细胞自噬和凋亡的影响

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1、解放军医学院博士学位论文全文总结55参考文献56综述63参考文献66攻读博士学位期间发表论文情况69致谢70万方数据解放军医学院博士学位论文丙酮酸乙酯对THP-1源性泡沫细胞自噬和凋亡的影响中文摘要目的：巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxygenizedlowdensitylipoproteins，ox-LDL)并转化为泡沫细胞。研究发现，泡沫细胞大量死亡可导致局部堆积大量脂质，斑块进展甚至破裂。细胞死亡方式包括：自噬性死亡，凋亡和坏死。丙酮酸乙酯(Ethylpyruvate，EP)是一种丙酮酸衍生物，多个研究显示该药物能通过抑制细胞自噬和凋亡，减少细胞死亡，从而发挥对脏器的保护作用。本

2、研究拟观察EP对泡沫细胞自噬和凋亡的影响，并初步探讨可能的机制。方法：1．THP—l源性泡沫细胞模型的构建：用不同浓度OX．LDL(Omg／L～150mg／L)诱导构建THP．1源性泡沫细胞模型。之后用油红O染色鉴定造模情况，用MTr法测细胞生存率。2．ox-LDL刺激对泡沫细胞自噬和凋亡的影响：THP．1细胞经PMA诱导贴壁后，给予不同浓度的OX—LDL(0mg／L-150mg／L)孵育24小时，用流式细胞术检测细胞自噬和凋亡水平，以筛选最佳模型构建条件。3．EP对THP一1源性泡沫细胞自噬及凋亡的影响：用上述研究筛选的最适OX．LDL浓度刺激泡沫细胞生成，应用不同浓度EP(5mM-2

3、0mM)进行干预，观察其对泡沫细胞自噬和细胞凋亡的影响。分组如下：①对照组：不加任何干预因素；②泡沫细胞组-力Ⅱ入100mg／L的OX—LDL；③低浓度EP组．力口入100mg／L的OX-LDL和5mM的EP；④中浓度EP组：加入100meffL的OX．LDL和10mM的EP：⑤高浓度EP组：加入100mg／L的ON—LDL和20mM的EP。共同孵育24小时后，用westemblot、流式细胞术、免疫荧光、PCR技术观察细胞自噬水平、细胞凋亡率。评估不同浓度EP对THP．1源性泡沫细胞脂质蓄积、细胞自噬和细胞凋亡的影响。用免疫荧光、PCR技术评估各组HMGBl水平表达的差异。4．EP对泡

4、沫细胞自噬和凋亡影响可能的分子机制：用免疫荧光、PCR技术评估OX．LDL组与ox-LDL+20mMEP组HMGBl、Beclinl、Rage等基因水平表达的差异，探讨EP作用于泡沫细胞自噬和凋亡水平可能的机制。结果：1．OX．LDL为25mg／L时，细胞生存率即下降至87．18％±5．34％(与对照组比较万方数据解放军医学院博士学位论文P<0．05)。随着OX．LDL浓度升高，细胞活力逐渐下降，油红O染色可见泡沫细胞内大量脂滴。2．THP一1源性泡沫细胞自噬率及凋亡率水平随着OX．LDL浓度增高增加，0mgL组，25mg／L组，50mg／L组，100mg／L组，]50mg／L组的自噬率

5、分别为0．05％4-0．01％，1．28％±0．32％，2．09％±0．17％，5．01％±0．33％，5．41％±0．27％，凋亡率分别为10．010／挂0．19％，20．360／o．4=3．42％，29．830／扯6．27％，49．29％士lO．66％，62．70'／社1．95％。但100mg／L组与150mg／L组间差异均无统计学意义(P>0．05)。3．流式细胞术、real．timePCR、Westernblot等检测手段证实，随着EP浓度增高，自噬率、自噬相关基因的表达水平逐渐下降。泡沫细胞组凋亡率较对照组明显增加(48．77"／硅7．22VS5．87+1．03)(P<0．05

6、)。不同浓度EP组(5mM，10mM，20mM)细胞凋亡率分别为26．12％±3．99％，12．92％±1．32％，9．46％±0．53％，均较泡沫细胞组明显下降(P<0．05)，凋亡标志性蛋白easpase．3表达随着EP浓度增加而减少。即随着EP浓度升高，凋亡率下降明显。4．免疫荧光染色、PCR显示OX．LDL+20mMEP组HMGBl、Beclinl、Rage和rn盯．Q基因mRNA表达水平较OX—LDL组显著下降。结论：1．以PMA诱导n坤．1细胞24小时可以促使该细胞贴壁分化为巨噬细胞；之后再以OX．LDL诱导泡沫细胞形成。方法简单可重复性好。2．在OX．LDL诱导THP．1源

7、性泡沫细胞中自噬和凋亡水平较对照组均增加。3．不同浓度EP可以抑制泡沫细胞中的自噬和凋亡，呈浓度依赖性。4．EP可能是通过抑制HMGBl减少了HMGBl．Beclinl互动及抑制HMGBl-RAGE通路来减少泡沫细胞中的自噬；可能是通过HMGBl．TLR4．TNF—Q轴通路来抑制凋亡现象。关键词：丙酮酸乙酯，泡沫细胞，HMGBl，自噬，凋亡，细胞死亡万方数据解放军医学院博士学位论文EffectofEthylpyruvateonaut