stoml-2抑制宫颈癌细胞铂诱导凋亡的机制

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1、硕士学位论文2．细胞腺病毒过表达细胞于转染前一天用不含抗生素的完全培养基接种于6孔培养板，2—4×105个细胞／111l／孔，转染时，细胞融合率应为40"～50％；按照不同的MOI值将腺病毒加入6孔培养板，将6孔培养板放入细胞培养箱培养；在感染细胞24、48、72小时分别用荧光显微镜观察细胞荧光表达情况。提取感染腺病毒细胞的全蛋白，用Westernblotting检测基因过表达效果。筛选感染效率合适的MOI值，进行过表达正式实验。3．MTT实验(1)检测对细胞增殖的影响细胞经过siRNA转染或者腺病毒过表达处

2、理后，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养72小时；加入配好的MTT溶液20ul／孔，于37摄氏度，5％C02培养箱避光孵育4小时，弃培养液，每孔加入DMSO溶液150ul，振荡10min摇匀，利用酶标仪检测～90的OD值。(2)检测HELA细胞和SIHA细胞顺铂的IC50用浓度为0，5，10，15，20，25，30，35，40ug／ml的顺铂处理HELA细胞，用浓度为0，2．5，5，lO，20，30，40，50，60ug／ml的顺铂处理SIHA细胞，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养24小

3、时；加入配好的MTT溶液20ul／孔，于37摄氏度，5％C02培养箱避光孵育4小时，弃培养液，每孑L；bl入DMSO溶液150ul，振荡10min摇匀，利用酶标仪检测～90的OD值。4．细胞克隆形成实验取对数生长的细胞，按照500或1000个细胞／孔接种于6孔培养板中，每孑L；bl入细胞悬液2ml，置于37摄氏度，5％C02培养箱内孵育24小时；按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞；将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养7天，第4天换液一次；去掉6孔板中的培养基，用冷PBS轻柔的冲洗2次，用4％

4、多聚甲醛固定15分钟，再用结晶紫染液染色20分钟，用流III万方数据摘要水冲洗干净，自然晾干，在显微镜下计数细胞数大于50个的细胞集落的数目。5．AnnexinV-FITC法检测STOML．2对细胞早期凋亡的影响按照上述细胞转染步骤处理细胞，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养48小时；更换新鲜的完全培养基，同时加入IC50量的顺铂，将细胞置于37摄氏度，5o％oC02的孵箱中培养6小时；离心收集细胞，3009，4摄氏度，5分钟，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞2次，用400ullxAnnexinV结合液

5、悬浮细胞，浓度大约为lxl06cells／ml。在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于4摄氏度避光孵育15分钟。加入10ulPI染色液后轻轻混匀后于4摄氏度避光孵育5分钟。经流式细胞仪检测细胞凋亡比例。6．线粒体内钙离子浓度的检测按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养48小时；更换新鲜的完全培养基，同时加入IC50量的顺铂，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养6小时；将黑色96孔培养板标记为：细胞样品孔、空白对照孔(不

6、含细胞)、最大对照孔(不含细胞)。用染色工作液处理各组细胞，放入37摄氏度细胞培养箱孵育30分钟，避免光照；即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光单位(I强U)，计算样品线粒体内钙离子浓度。7．细胞凋亡线粒体膜电位的测定按照上述细胞转染步骤处理细胞，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养48小时；更换新鲜的完全培养基，同时加入IC50量的顺铂，将细胞置于37摄氏度，5％C02的孵箱中培养6小时；用JC．1工作液处理各组细胞，置于37摄氏度，5％C02培养箱内孵育20分钟；室温离心2000rpm，5分钟收集

7、细胞，用lxIncubationBuffer洗2次；吸取500ullxIncubationBuffer重新悬浮细胞，采用流式细胞仪检测。IV万方数据硕士学位论文8．RT．PCR按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞，提取RNA，逆转录形成cDNA，然后按照95"C30sec1个循环、95。C5sec、60。C34sec40个循环进行PCR，用2以△C‘法进行相对定量分析，计算基因的相对表达量。9．Westernblotting细胞经过各种处理后，提起全蛋白或者线粒体蛋白和胞浆蛋白，用恒压进行电泳，电泳结

8、束后采用恒流的条件进行转膜，然后采用5％脱脂奶粉封闭1小时，4摄氏度过夜孵育一抗，避光孵育二抗1小时，用机器进行曝光，并用quantityone软件进行条带的定量分析。实验结果1．RT-PCR及Westernblotting检测STOML．2沉默和过表达的效果采用siRNA转染HELA和SIHA细胞以干扰STOML．2基因的表达，RT-PCR及Westernblotting的结果表明，以第2号siR