necrostatin1在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的延迟性心肌保护作用

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1、山西医科大学硕士学位论文Necrostatin．1在大鼠心肌缺血／再灌注损伤中的延迟性心肌保护作用摘要研究背景：据世界卫生组织(WHO)报道，急性心肌梗死(AcuteMyocardialInfarction，AMI)是人类心血管疾病最重要的死亡原因之一。AMI常由血栓阻塞冠状动脉所引起，导致不可逆的心肌细胞死亡。此时，尽早对缺血区进行血液再灌注是挽救心肌细胞死亡的唯一有效途径，但是再灌注本身亦会加重缺血后心肌细胞损伤，即再灌注损伤。随着再灌注后心肌细胞的大量丢失，纤维组织反应性增生进而形成瘢痕，不仅导致心功能障碍，严重时甚至会诱发心力衰竭。目前越来越多的证据表

2、明：通过阻断细胞死亡通路，可以明显的缩小心肌梗死面积，改善心功能；因此，减少心肌细胞死亡己被认为是一种治疗缺血／再灌注损伤的潜在途径。长期以来，心肌缺血／再灌注损伤所导致的心肌细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡两种主要形式。尽管细胞坏死在心肌梗死区中所占比重较大，但凋亡作为程序性细胞死亡形式被认为比细胞坏死更具可调控性。然而，近年来许多研究发现均提示：凋亡并非唯一的程序性死亡方式；在心肌缺血／再灌注损伤中，延迟性细胞坏死也呈现出程序性死亡的特点，如自噬性细胞死亡(Autophagiccelldeath)，也称程序性细胞死亡II型。那么，如果能在信号通路上阻断这种细胞

3、死亡方式，将有可能寻找出一条治疗缺血／再灌注损伤的新途径。程序性细胞死亡II型在形态上主要表现为细胞内自噬体的大量聚集，自噬作用本身是一种细胞在恶劣环境下得以存活的自救行为，在一定范围及程度上的自噬作用对细胞起保护作用，而超出此范围将会导致细胞损伤。虽然下调自噬体的形成，如使用自噬体特异性抑制剂——3．甲基腺嘌呤(MA3)，可以有效地阻断某些病理原因所导致的细胞死亡过程。但近来有许多研究己表明：有些病理原因所导致的细胞死亡，如心肌缺血／再灌注损伤，应用N'L&3不但不能减少细胞的死亡，反而加重了心肌的损伤。因此，有人提出：自噬途径的上游机制才是调节自噬性细胞死

4、亡的关键；但是，由于缺乏合适的工具而限制了对其机制的进一步研究。2005年哈佛大学医学院的袁钧英教授(JunyingYuan)幂D她的研究小组在((NatureChemicalBiology)上报道一种小分子物质——-Necrostatin．1(简称Nec一1)，能够特异性地抑制Fas／1NFR所诱导的以自噬体积聚为特征的非凋亡性细胞死亡——Necroptosis(意译为程序性坏死)。这种能被Nec．1所抑制的死亡方式同时兼具了凋亡的程序性特征和白噬性细胞死亡的形态学特征。该研究结果进一步显示：Nec．1对这种细胞死亡方式的阻断并非通过III山西医科大学硕士学

5、位论文抑制细胞的自噬途径。因此，作者认为Nec．1可能是通过阻断自噬的上游途径而抑制这种细胞死亡方式的，而研究Nec．1作用机制将有助于揭示程序性坏死的上游途径。目前，由于Nec—l能否抑制大鼠心肌缺血／再灌注导致的细胞死亡尚不明确；因而，确定Nec—l对大鼠心肌缺血／再灌注损伤中的作用将是我们首要解决的问题。目的：1．观察Nec一1在MI／R过程中是否具有心肌保护作用，进而推断Necroptosis是否参与TMI／R诱导的心肌损伤。2．如果上述目的被证实，进一步观察Nec．1对不同时间点缺血／再灌注心肌的保护作用，以推测在缺血／再灌注d?Necroptosi

6、s发生的时间窗。方法：雄性SD大鼠，建立在体心肌缺血(I2weeks)或缺血／再灌注模型(130min，R12h、24h、48h、72h)，并分别于缺血前或再灌注时，鼠尾静脉注射Nec．1或相应溶剂，即治疗组和溶剂对照组。观察心肌缺血／再灌注后的左心室功能改变，使用Masson三色染色的方法测定心肌梗死面积并观察光镜下受损心肌中纤维组织反应性增生以确定左心室重构的程度，并检测再灌注后不同时间点血清肌酸激酶(CK)的含量，从而明确Nec．1在大鼠心肌缺血／再灌注损伤中是否具有心肌保护作用。然后，通过测定受损心肌组织自噬体标志物MAP．LC3II表达量(Weste

7、mblot)，并于电镜下观察心肌组织形态学超微结构的改变，从而研究心肌组织中的细胞程序性坏死是否具有自噬的特征。最后，通过分析缺血／再灌注不同时间点上MAP．LC3II表达量和血清肌酸激酶活性之间的相关性，从而确认在大鼠心肌缺血／再灌注损伤中Nec一1的作用与自噬样的程序性坏死之间的相关性。结果：1．Nee-1可以降低MI瓜大鼠血清中的CK水平肌酸激酶是心肌中特有的一种分子物质，心肌缺血／再灌注损伤诱导心肌细胞膜破裂，引起血清CK水平的升高，已被普遍地认为是一项反映心肌损伤的重要指标。实验结果显示：心肌缺血前，各组大鼠血清CK水平无差别(232±34U／L)；

8、而在心肌缺血／再灌注后，血清CK水平较