egfpn1h2b1质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

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1、缩略词表缩写词英文全称中文全称ddH20doubledistilledwater双蒸水DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸dsRNA双链RNAEBethidumbromide溴化乙锭EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸FACSflurescenceactivatedcellsorter流式细胞术GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白瑚C主要组织相容性复合体PBS磷酸缓冲盐溶液PCRP

2、olymeraseChainReaction聚合酶链反应TBETris／硼酸缓冲液TBS三羟甲基甲烷盐酸缓冲液Tris三羟甲基胺基甲烷VEC血管内皮细胞放线菌素DMay,2008独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均甬在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后渠。学位论文作者签名：酲期：年胃尽学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关傈黧、经I霭

3、学位论文的规定，即：学校有权谦留并囱国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被套阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或捆描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：山西医科大学硕士学位论文pEGFP-N1-H281质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞凋亡和增殖的影响中文摘要目的心脏移植是临床治疗终末期心功能衰竭的唯一有效手段，但术后急、慢性排斥反应严重制约着该技术的广泛推广应用。研究诱导

4、免疫耐受方案意义重大。母胎免疫耐受是天然的同种异体免疫耐受模型。位于母胎界面的绒毛膜组织不表达经典的HLAI类分子而表达非经典HLA1分子(包括HLA．G等)是母胎耐受的重要机制之一。本研究通过提取小鼠母胎界面的特异性的H281基因，构建pEGFP-N1一H281质粒载体，并转染至小鼠血管内皮细胞，观察pEGFP-NI．H281质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响，探讨利用母胎免疫耐受介导术后移植排斥反应的机制。方法本研究分为两部分：第一部分双酶切技术和基因测序对重组pEGFP-N1．H281质粒载体进行鉴定；第二部分转染pEGFP-N1．H281至小

5、鼠血管内皮细胞，观察pEGFP-N1．H281质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。pEGFP-N1．H281质粒载体构建过程中，首先在小鼠胎盘提取总RNA，PCR扩增H2Bl基因；然后用内切酶EcoRI和BamHI双酶切将PCR产物连接至T载体，并进行基因测序；最后利用内切酶EcoRI和BamHI对重组TS．H281和pEGFP-N1进行双酶切，将H281亚克隆至pEGFP-N1，并利用内切酶XhoI、BamHI双酶切法进行鉴定。转染pEGFP．N1．H281质粒载体于小鼠血管内皮细胞，并对小鼠血管内皮细胞进行倒置显微镜下观察、生长曲线绘制以及免疫组

6、织化学进行鉴定。实验分为空白对照组和实验组，分别以不同浓度的pEGFP-N1．H281质粒载体进行干预：细胞刺激生长实验分别以2．5rtg／mL、5pg／mL、10肛g／mL干预小鼠血管内皮细胞，细胞计数观察1—6天小鼠血管内皮细胞的变化；MTT检测小鼠血管内皮细胞增殖情况，分别以2．5一mL、5嵋／lnL、10pg／mL干预小鼠血管内皮细胞，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞调亡，分别以2．Srte／mL、5“∥mL、10vedmL干预小鼠血管内皮细胞，转染后24h、48h、72h处理细胞，观察随时间变化细胞凋亡情况，并绘制曲线。

7、结果pEGFP-N1．H281质粒载体构建过程中，1％山西医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶中电泳对PCR产物进行检测，观察到在1070bp处有一条亮带，于H2bl基因的分子量相对应；1％琼脂糖凝胶中电泳对TS．H281载体的鉴定，观察到三个克隆片段均在1070bp处有一条亮带，证明三个克隆片段均为正确克隆：基因测序显示只有两个碱基突变；XhoI、BamHI双酶切法对pEGFP-N1．H281质粒载体的鉴定，观察到两个克隆片段均在1070bp处有一条亮带，证明两个克隆片段均为正确克隆。倒置显微镜观察小鼠血管内皮细胞生长情况，培养48h后，可见大部分贴壁细胞连接形成网

8、状，细胞密度较低；3．5