dgfpdgfr在原发性血小板增多症中的作用及机制

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1、硕士学位论文PDGF／PDGFR在原发性血小板增多症中的作用及机制硕士研究生：周丽霞指导教师：杨默摘要研究背景与研究目的原发性血小板增多症(Essentialthrombocythernia，ET)是一组以骨髓巨核细胞和外周血血小板持续增高为主要临床特征的骨髓干细胞恶性克隆性疾病。ET患者因功能缺陷的血小板过多易导致血管栓塞和出血，重要脏器栓塞和出血常常危及患者生命。科学家们发现约55％ET患者携带JAK2／V617F突变，约25％ET患者携带网钙蛋白(CALR)基因突变，3％的ET患者携带血小板生成素(thrombopoietin，TPO)受体MPL基因突变。然而，仍有近

2、20％的ET患者并不携带其中任何一种基因突变。这表明ET的发病机制还未被完全阐明。在关于MPN信号通路的研究中发现，ET患者骨髓中P．STAT3和P．STAT5表达升高，且与JAK2／V617F阴性的ET患者相比，携带JAK2／V617F的ET患者骨髓中P．STAT5表达显著升高，而P-ATAT3的表达并无差异。在携带JAK2／V617F的小鼠模型中，科学家们证实STAT5的JAK2／V617F导致骨髓增值性疾病中必要的分子信号，而并不依赖于STAT3等细胞信号分子。这说明，JAK／STAT是携带JAK2／V617F的ET患者发病中的重要通路，尤其是STAT5；而ET患者中

3、异常活化的STAT3还存在其他的重要的上游启动信号。血小板衍生生长因子(Platelet．derivedgrowthfactor，PDGF)最早发现于活化血小板中，是一种重要的内源性生长因子，它的受体PDGFR是酪氨酸酶家族之一。PDGF通过磷酸化作用于PDGFR，而启动一系列细胞信号通路发挥其生物万方数据摘要学效应。KaminskiWE等发表在Blood上的文章表明，敲除小鼠的PDGF．B和PDGFR．D基因可诱发包括血小板减少在内的一系列血液系统缺陷。这提示PDGF与造血系统有密切关系，并且已经有研究证实PDGFR在巨核细胞表明的表达。在骨髓抑制小鼠模型中，PDGF能促

4、进其血小板的恢复；并且细胞实验中进一步证实PDGF通过作用于PDGFR，顺而激活巨核细胞P13K／AKT信号通路，促进巨核细胞增殖同时抑制其凋亡。然而，PDGF／PDGFR与血小板疾病的关系却鲜有报道。在Blood有研究报道，PDGF在ET患者外周血血清中表达显著升高，且进一步被证实为PDGF．BB亚型。因此，我们提出PDGF／PDGFR可能在原发性血小板增多症的发病机制中有潜在的作用。酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(Imatinib)，最早被用于治疗BCR．ABL阳性慢性粒细胞白血病。近年来，随着对酪氨酸激酶抑制剂的作用靶点的不断认识，其在血液系统疾病的应用也不局限于ph阳

5、性的慢性粒细胞白血病和ph阳性的急性淋巴细胞白血病。作为酪氨酸激酶家族成员之一，PDGFR的活性及其诱导的生物学效应也会相应地被伊马替尼阻断，如酪氨酸激酶抑制剂对伴有PDGFRB突变的MPN和ph样ALL治疗有效率近100％，但其针对PDGFR治疗原发性血小板增多症还未见报道。本研究目的，检测原发性血小板增多症患者PDGF及PDGFR的表达水平，并通过动物实验观察增高的PDGF水平对血小板生成的影响，明确其在ET发病中的作用；进一步探索PDGF／PDGFR于ET发病中的分子机制；并以PDGFR为靶点，探索酪氨酸酶抑制剂，伊马替尼对ET的治疗作用。研究内容与研究方法一、检测E

6、T患者PDGF．BB及PDGFR．B的表达水平1、研究对象研究对象为2012年5月到2014年4月因外周血血小板增多(血小板>450×109／L)就诊于本研究单位，通过骨穿结果，分子生物学结果，排除继发性血小板增多，诊断为原发性血小板增多症的患者；对照组为本单位造血干细胞移植健康供者。II万方数据硕士学位论文2、酶联免疫吸附试验测ET患者及正常人骨髓血清PDGF．BB表达标本来源于骨髓，用EDTA抗凝管收集标本后，6009离心15rain，分离上清液冻存于．80℃冰箱，统一检测。将标本和试剂盒于室温解冻，根据既往文献报道人血清中PDGF．BB浓度，用PBS将标本稀释5倍；所

7、有标本一式3份加样；加样后室温震荡孵育2．5h，清洗后加抗体室温震荡孵育1h后清洗，加显色剂后，于酶标仪显色，读取吸光度。3、流式细胞技术检测ET患者PDGFR．p的表达来源于骨髓的标本收集血清后，剩余细胞用溶血液溶解红细胞后，离心，用PBS洗涤两遍，剩余细胞为用PBS重悬使细胞浓度为1×107／rnl，加入CDl40b．PE20I．tl／100¨l，室温避光温孵育30min后洗涤，重悬于PBS，每管取1×106个细胞，上机。二、体内观察PDGF．BB对小鼠血小板生成的影响取6．8周龄的雌性Balb／c小鼠16只，