aspcr检测hiv1微量耐药突变方法的建立和初步应

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1、优秀毕业论文中国人民解放军军事医学科学院硕士学位论文ASPCR检测HIV--1微量耐药突变方法的建立和初步应用姓名：郭东星申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：李敬云20100610精品参考文献资料优秀毕业论文硕士学位论文摘要ASPCR检测HIV_l微量耐药突变方法的建立和初步应用中文摘要在艾滋病抗病毒治疗前期或治疗过程中及时了解HIV耐药毒株存在和发生情况，对抗病毒治疗方案的制定具有很好的指导作用。检测劣势耐药毒株可以更好地了解耐药性产生的机理并及时地指导临床抗病毒治疗，尽可能延缓病人耐药的出现。目前常用的H】V耐药检测方法是以测序为基础的基因型分析方法，如hho

2、use法和Ⅵ∞Seq基因型耐药检测系统。这些方法在耐药毒株占病毒准种的20％～30％以上时才能检出，不能检出微量耐药突变，不能满足临床早期诊断耐药及研究耐药进化路径的需要。相对于基因型分析方法，～lele-spcci丘c他al-tin℃PCR(AsPCR)方法能够高效检出微量(0．01％～1％)耐药病毒准种。本研究针对我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中最常见的K103N、M184I／M184V、1215F／1215Y耐药突变位点，建立了AsPCR检测耐药突变的方法，验证了这个方法的特异性、灵敏度、准确性和重复性。使用建立的AsPCR方法对76例接受抗病毒治疗的艾滋病患者进

3、行了耐药突变毒株检测及其占病毒准种比例的分析，并对10例艾滋病患者的系列样本(共64份)进行了5个耐药突变发生发展的监测。第一部分AsPCR方法的建立及验证建立了AsPCR检测5个常见耐药突变的方法，包括：(1)设计并制备主要试验材料。以HⅣ1州．3质粒为模板，分别扩增两端都带有酶切位点的并且含103、184、215位点的Dl妊片段，将其连接到喊体，进行定点诱变并转化测序，得到含K103N、M184I／M184V、1215F／T215Y耐药突变的质粒作为标准品。设计特异性和非特异性的引物用以区分野生型和突变型质粒。制定SYBR孕een荧光法进行实时定量PCR，检测上述耐

4、药突变的流程和结果判定标准。(2)对建立的AsPCR方法检测各个突变位点的特异性、灵敏度、准确度、重复性等进行验证，包括用构建的含有耐药突变的质粒进行的验证、用传统基因型方法检测存在相应耐药突变的样本和野生型病毒培养上清进行的验证和构建并包装含有突变的病毒及在1精品参考文献资料优秀毕业论文硕士学位论文摘要病毒水平上的验证。在病毒水平上的验证，做法是，将经过测序鉴定的带有突变位点的片段从喊体上双酶切下来，并与经过处理的pl、订4-3的骨架进行连接，然后转染293T宝田胞，得到了野生型病毒和含相应耐药突变位点的假病毒。测定含有Kl03N、K103K和M184I(本室保存)的

5、包装病毒的病毒载量，将含耐药突变的病毒与野生型病毒根据载量按比例混合，提取混合病毒的砌、IA，进行一步法逆转录，对稀释后的第一轮PCR产物进行实时定量检测，在病毒水平上验证方法的准确性和灵敏度。主要结果如下：1、建立了AsPCR检测5个常见HIVl耐药突变(K103N、M184I／M184V、1215F／1215Y)的方法，构建了5个耐药突变的标准质粒、设计了特异性和非特异性引物、制定出检测流程和结果判定标准。用这个方法能够准确地检测出标本中是否含有某种耐药基因突变及携带耐药突变的毒株占病毒准种的比例。2、AsPCR标准品制备良好，标准曲线的相关系数，均大于o．99，能

6、够准确反映模板量和C值间的线性关系，可以用于待测样本的定量。3、各个突变位点的特异引物对野生型和突变型模板具有良好的分辨力、准确性和重复性，批次间和同批次内的变异系数均低于o．42。4、质粒水平验证结果显示，AsPCR检测K103N、1215F、T215Y的灵敏度可达0．04％，0．03％和O．02％；检测M184V和M184I的灵敏度可达O．4％和03％。5、在病毒水平验证结果显示，AsPCR检测Ⅻ螺11s类耐药位点K103N的灵敏度可达O．02％左右，检测NRTIs类耐药位点M184I的灵敏度可i大0．01％。且混合病毒的AsPCR测定比例与理论比例具有良好的一致性

7、。因此，ASPCR方法的前期流程(RNA提取、逆转录、第一轮普_i鄱CR)对方法的灵敏度、准确性无明显影响。6、建立的AsPCR方法对阴阳性对照样本具有良好的检测能力，K103N、M184I、M184V、T215F和T215Y的△Ct临界值分别为12．5、8D、9．7、16和12，可以用于对实际样本的检测。第二部分ASPCR方法在检测HⅣ．1微量耐药突变中的应用利用建立的ASPCR方法对临床样本进行了相应耐药位点的检测。对76份血浆样本分别进行了K103N、M184I／M184V、亿15F／1215Y横断面检测，检测了10例(64人份)我