本次实验项目.doc

《本次实验项目.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、本次实验项目：　　　　实验二　醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白本次实验课时：5学时教学要求：1．掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。2．学会使用38B型电泳槽及点样技术。重点：滤纸桥的制做、薄膜的处理、点样难　　点：点样教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配：课堂讲授1．相关知识……………………………………………………………　　……　0.1学时2．实验目的…………………………………………………………………　　…0.1学时3．实验原理……………………………………………………

2、………………　　0.3学时4．实验操作　　　　　……………………………………………………　　…0.2学时实验教学醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白……………………………………4学时参考资料《生物化学实验》　　　　　　　实验教学教案首页醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白（验证性）相关知识１．血清蛋白：血清中含有多种蛋白质，它们之中有的和某些糖类结合，形成糖蛋白。　　　　　　　　人血清中蛋白质的等电点及相对分子质量蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量/Mr白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.

3、85.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~300000２．醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强（厚度120微米），对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，可以很好的消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，具有用样量少（5μg的蛋白质可得到满意的分离效果），分离清晰，无吸附作用。醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。３．氨基黑：1,4-氨基-5-羟

4、基-3-(对硝基苯偶氮)-6-(苯偶氮)-2,7-萘二磺酸二钠盐1,4-氨基-5-羟基-3-(对硝基苯偶氮)-6-(苯偶氮)-2,7-萘二磺酸二钠盐　　是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区有很大的亲和力。因此，以凝胶基质作为电泳支持物时由于亲水的凝胶基质与氨基黑有很大的亲和力，不容易漂洗，一般不使用它进行染色。４．根据电荷不同的纯化方法之一―――电泳５．血液：分为血细胞和

5、血浆①血细胞：包括红细胞白细胞血小板（凝血）②血浆：是不含血细胞的。血浆中溶解着血纤蛋白原，它可转变成不溶性的血纤蛋白。③血清：是不含血纤蛋白原的血浆６．临床意义急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，α1、α2和β-球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，β、γ-球蛋白升高；急性炎症时，α1、α2-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ-球蛋白区带之间

6、出现“M”带。一、实验目的掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。二、实验原理蛋白质是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基不同，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷也不同，因此，在电场中迁移速度不同。在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。正常

7、人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示五条区带。该方法目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、同工酶、多肽、核酸及其它生物大分子。具有操作简单、快速、廉价的特点。三、实验仪器、材料与试剂　（一）实验仪器DYY-Ⅲ型电泳仪、38B型电泳槽、染色和脱色装置（自制）、血色素点样器（自制）、单面刀片、镊子、吹风机、普通滤纸、醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）。（二）材料　新鲜人血清（三）试剂1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液：（pH8.6,0.07mol/L，离子强度0.06）

8、；称取1.66g巴比妥（A.R）和12.76g巴比妥钠(A.R)，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，置4℃保存备用.2．血清蛋白染色液:称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇(A.R)50ml，冰乙酸(A.R)10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。3．漂洗液：取95%乙醇(A.R)45ml，冰乙酸(A.R)5ml，和蒸馏水50ml，混匀置具塞试剂瓶贮存。4．透明液：透明液甲：取冰醋酸(A.R)