鳜鱼nfκb家族基因的克隆和鉴定

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1、中山大学硕士学位论文周志成中文摘要鳜鱼NF-lcB家族基因的克隆和鉴定硕士生：周志成导师：何建国教授鳜鱼是我国重要的鱼类养殖品种，具有较大经济价值。NF-rB家族是一类重要的转录因子，在免疫、凋亡、发育等方面发挥着重要的作用。为了更好地研究鳜鱼的先天性免疫机制，通过改良的简并引物设计法，钓取出NF-r．B家族∥05．胎馏、p65,p100和c-Rel的表达序列标签(ExpressionSequenceTag，EST)。通过快速扩增cDNA末端(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)技术，克

2、隆得到了NF一如家族5个基因的全长eDNA序列。其中p105和RelB的cDNA序列是鱼类中首次报告，而p65．p100和c-Rel的cDNA是鱼类中的第二次报告。通过对NF-mBI(P105／P50)和NF-r．JBZ(PlOO／PS2)的氨基酸序列进行比对分析，发现这鳜鱼的这两个基因和高等脊椎动物相对应的基因同源性比较高付目似性大多在50％以上)，且具有相似的结构域，推测可能两者有相似功能机制。构建进化树进行分析发现P105和P100分别与哺乳类的P105和P100聚类在一起，表明两个基因在鱼类出现以前已经发生了分

3、化，重组表达出P105的RHD序列，为NF-rB与Ir．B结合实验打下基础。应用实时定量PCR技术，分析了∥∞和脚叩在健康鱼中的组织分布。组织分布结果显示，p105和p100在除肌肉外所有组织均有分布。其中∥晒在头肾中表达较高，在肝中表达量较低；而p100在鳃中表达较高，在肝中表达量较低。【关键词】鳜鱼；简并引物设计法；RACE；pET-32a+；Real-timePCR；中山大学硕士学位论文周志成Molecularcloningandcharacterizationofmandarinfish(Sinipercach

4、uatsi)NF-rOBfamiliygenesThepredatoryfreshwatermandarinfish，Sinipercachuatsi(Basilewsky)，isanimportantfarmedfishspeciesinChina．ThefamilyofNF-KBtranscriptionfactorsplaysanindispensableroleinimmunity,apoptosis，cellcycleregulationandSOOILHere，wehaveuseddegeneratepri

5、mersandrapidamplificationofeDNAends(RACE)toobtainfull-lengthcDNAofpl05、忍坍、p65、p100andc—Rel．whichatethemembersofNF-rBfamily．ToOUrknowledge．p105andRelBwasreportedforthefirsttimeinfish．TheclustalWanalysisshowedthatthetwogenesfrommandarinfish，Sinipercachuatsihadhigh

6、identitywiththecorrespondinggenesinadvancedveterbrate，whichimpliedthattheysharesimilarstructuredomainsandthefunctionalmechanism．AphylogenetictreeconstructedwithdifferentP105sandP100soffish(predicted)andmammalsgroupedoursequencestomammalianp105andp100respectively

7、，suggestingthatthegenesweredifferentiatedbeforetheemergenceoffish．RecombinantRHDdomainswereexpressedtoprovidethefootstoneforthebindingassayoftheNF-rJBproteinandthelrBprotein．QuantitativeRT·PCRwasusedtodetectthetissuedistributionofheaRhymandarinfish．TheresuRshowe

8、dthatp105andp100wereexpressedinthemosttissuesexceptmuscle．Expressionlevelofpm5ishighestinheadkidneyandlowestinliveT，whilethatofpl00ishighestingillandlowestinliver．[Ke