生物化学实验项目学生用(张艳馥)

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1、实验一、圆形滤纸层析法分离氨基酸一、实验H的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法二、实验原理1、纸层析是以滤纸为支持物的层析。包括水平层析、垂直层析。垂直层析中又包括上行法和下行法。本实验为水平层析，其点样点为滤纸屮心。2、纸层析所用展层剂大多为水和有机溶剂组成。水：与纤维素亲和力较强一一固定相有机溶剂：与纤维素亲和力较弱一一流动相3、不同氨基酸巾于R基的不同，极性不同因此在两相中的分配系数不同，所以氨基酸随流动相流动的速度不同，于是将不同的氨基酸分离开，形成距原点距离不同的层析点。4、溶质在滤纸上的移动速率用比移R

2、f表示RF原点到层析点巾心的距离/原点到溶剂前沿的距离层析条件不变Rf为常数，故可根据Rf值作定性依据。三、实验器材1、圆形滤纸（直径15cm）、滤纸条2、毛细管3、培养皿（直径12cm左右）4、电吹风5、喷雾器6、剪刀、圆规、铅笔、格尺四、实验药品1、标准氨基酸溶液：0.5%脯氨酸、0.5%亮氨酸、0.5%精氨酸2、展层剂：正丁醇：醋酸：乙醇：水=4:1:1:2混合后的上清液3、显色液：0.1%茚三酮-乙醇（95%）液4、混合氨基酸：将上述各氨基酸液等量混合五、实验步骤1、滤纸处理：（1）分区找原点（2）做滤纸桥

3、（3）画点样原点2、点样：用不同毛细管分别蘸取不同样品点至相应区域的点样原点，样点直径不超过3mm,吹干或自然干燥，少可补点一次。3、层析.•（1〉取培养皿一个，加入展层剂（2）将点样后的滤纸桥向下平放于培养皿上，并使纸桥浸入展层剂中（3）取等大的、干燥的培养皿盖于其上进行展层（4）待展层剂达到培养皿边缘时层析结朿，取出并用铅笔划一前沿线（5）川电吹风吹干4、染色：用0.1%茚三酮浸染后，吹干即出现层析点六、实验分析1、计算（1）各已知氨基酸的Rf（2）计算各未知氨基酸的Rf（3）确定未知氨基酸的种类2、讨论（1）

4、为什么不同氨基酸通过层析可以被分开，影响Rf的因素有哪些？（2）列出至少2种其他的层析方法，并简述其原理实验二、酪蛋白的制备及其等电点的测定一、实验目的1、了解蛋白质的两性性质与等电点及蛋白质沉淀的关系2、掌握沉淀法测定蛋白质的等电点的原理和方法二、实验原理1、提取（1）牛乳屮含有丰富的酪蛋白（2）酪蛋白为两性物质，等电点为4.7（3）等电状态蛋白质易形成沉淀，调节牛乳的pH=4.7则酪蛋白沉淀出来（4）酪蛋白不溶于乙醇，故可用乙醇进行提纯2、等电点测定（1）等电点时蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大（2）配制不同

5、pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即付确定代白质的等电点三、实验器材1、离心机2、水浴锅3、量筒（100ml）、烧杯（400ml、500ml）4、试管（15ml）、试管架、移液管（10ml、2ml、lml）5、研钵6、锥形瓶（200mol、1OOmol）网、实验药品1、牛奶2、95%乙醇、无水乙醚3、0.2mol/LpH4.7醋酸一醋酸钠缓冲液：177A液+123B液混合A液：0.2M醋酸钠溶液；B液：0.2M醋酸溶液4、干酪素5、lmol/L醋酸钠溶液6、lmol/L、0.lmol/L,0.01mo

6、l/L醋酸溶液五、实验步骤（一）酪蛋白的提取1、提収（丨）取牛乳100ml与400或500ml烧杯巾，放入40'C水洛锅巾预热（2）取100mlpH4.7的缓冲液100ml同样预热到40°C（3）将缓冲液加入到牛乳中，边加边搅拌，最终调pH为4.7（4）冷却后倒入离心杯屮3000转离心15min,取出后去上清的酪蛋白粗品2、洗涤（1）用蒸馏水洗涤沉淀3次，每次3000转lOmin（2）用30ml乙醇洗一次（3）乙醇-乙醚等量混合液洗一次（4）无水乙醚洗一次3、干燥将沉淀瘫在表而皿上，风干（二）酪蛋白等电点测定1、0

7、.4%酪蛋白醋酸钠的配制：（1）称取0.4g干酪素加少量蒸馏水在研钵中仔细研磨（2）将研磨好的酪蛋白转至200mol锥形瓶屮，并用少量温水洗涤研钵，将洗液并入锥形瓶中（3）加入lOmollmol/L醋酸钠溶液后置50°C水浴中，摇动至酪蛋白完全溶解（4）将溶解后的酪蛋白液转至lOOmol锥形瓶屮蒸馏水定容至刻度，塞紧混匀。2、等电点测定：（1）取同样规格的4支试管，按下表操作后混匀试管号蒸馏水（mol）0.01.M0L/1醋酸(mol)0.1.M0L/1醋酸(mol)1.M0L/1醋酸(mol)18.40.6——2

8、8.7—0.3—38.0—1.0—47.4——1.6（2）向以上各管中加入酪蛋白醋酸钠液各lmol，加以管混一管，此时各管pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5（3）观察各管浊度，静止lOmin后再观察各管浊度，确定酪蛋白等电点六、实验分析1、计算酪蛋白得率：（1）含量=酪蛋白克数/100（g%）（2）得率=测得含量/3.5%2、解释蛋白质为什么在等电点时