输精管结扎对前列腺细胞凋亡调控的实验与临床分析

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1、-1输精管结扎对模型犬前列腺组织学及细胞凋亡调控的实验研究1.1材料和方法1.1.1实验动物1.1.1.1雄性杂交犬12只，体重8.0-14.0kg,平均11.5kg,犬龄5-6岁，由本校动物室和宜昌市民丰种犬场提供。1.1.1.2动物饲料：普通犬饲料，按每只犬1mg.kg-1.d-1标准添加甲基睾丸素（中外合资镇江吉贝尔药业有限公司生产）制成混合饲料喂养。1.1.2实验仪器1)半自动前列腺穿刺针，由浙江奉化医疗用品厂生产。2)HM340E型电脑程控旋转切片机，由德国Microm公司生产。3)Leica

2、CM1800型冰冻切片机，由德国Leica公司生产。4)LeicaEG1150型石蜡包埋机，由德国Leica公司生产。5)LeicaDMR+Q550型病理图像分析仪（配备显微摄像系统）及其图像分析软件，由德国Leica公司提供。1.1.3主要试剂1)4%多聚甲醛缓冲液，由多聚甲醛40g、0.1mol/L磷酸缓冲液加至1000ml配成，pH调至7.3，用于组织标本固定。2)增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、凋亡抑制基因（Bcl-2）单克隆抗体及促凋亡基因（Bax）多克隆抗体购自中国武汉博士德生物有限公

3、司，二抗及免疫组化SABC试剂盒均为中国Boster公司产品。1.1.4实验方法1.1.4.1犬前列腺增生模型制作及标本的制备1)12只雄性杂交犬以混合饲料喂养，2年后随机选取2只，用25%乌拉坦按750mg/kg剂量行腹腔注射，麻醉成功后，消毒肛周及直肠，左手食指伸入直肠内扪及前列腺并作导引，右手持半自动前列腺穿刺针刺入前列腺内取出少许组织作快速冰冻切片，光镜下观察证实前列腺组织均呈典型增生改变，确认造模成功。2)动物分组及处理：立即将12只造模成功的犬随机分为A（结扎组）、B（假手术组）两组，按上述

4、方法麻醉后,对A组6只犬施行双侧输精管及其静脉结扎术，具体操作方法如下：0.5%碘伏液消毒手术野，在阴囊壁前外侧中上1/3皮下扪及一侧输精管后以左手“三指法”固定，右手持尖刀片沿输精管纵向切开阴囊皮肤约0.5cm,然后用输精管分离钳刺入皮下，分离输精管周围组织，显露输精管及其被膜，切除约1cm输精管，随后将输精管连同输精管静脉一同结扎，仔细止血后，以5-0肠线缝合------2------各层组织，依法处理对侧输精管；B组6只犬仅解剖显露输精管，不结扎即缝合各层组织，术后观察无出血及感染，按上述方法分组

5、继续饲养两年，然后称取体重并全部处死（割断颈动静脉法），手术解剖出前列腺称重，用量杯加水法测量前列腺体积。3)光镜与免疫组化检测标本的制备：取材后的前列腺标本分组编号，迅速置入4%多聚甲醛缓冲液中固定，石蜡包埋后，每例标本分别连续切片，切片厚度约4μm，60℃烤干4h，置4℃冰箱保存，分别做HE染色（苏木精-伊红染色）、免疫组化染色检测PCNA及Bcl-2、Bax蛋白表达。1.1观察并检测两组犬前列腺组织学的变化1)将A、B两组犬已解剖出的12例前列腺标本分别称重，用量杯加水法测量前列腺体积，比较两组前

6、列腺重量及体积的差异。2)光镜观察HE染色切片组织病理学改变（10×10低倍和10×40高倍镜）A、B两组犬每例标本切5张切片，共60张，常规HE染色，步骤如下：采用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（Ⅰ）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min；苏木素染色5min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s（提插数下）；自来水浸泡15min，置伊红液2min，常规脱水，透明，封片：95%乙醇（Ⅰ）1min→95%乙醇（Ⅱ）

7、1min→100%乙醇（Ⅰ）1min→100%乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石炭酸（3：1）1min→二甲苯（Ⅰ）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。3)用LeicaDMR+Q550型病理图像分析仪及其图像分析软件分别测量两组组织构成百分比（腺上皮面积比、间质面积比）及腺上皮平均高度，每张切片随机选取5个视野（10×20），取测量平均值。4)结果判断：光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆淡红色，凋亡细胞在组织中单个散在分布，核染色质致密浓缩，核碎裂等[8]。1.2免疫组化检测两组犬前列腺细胞凋亡的变化

8、1)免疫组化SABC法检测PCNA及Bcl-2、Bax蛋白的表达石蜡切片（每例标本每个指标均切片检测5张）脱蜡至水；蒸馏水新鲜配制3%H2O2孵育10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次；修复抗原：将切片浸入0.02MPBS缓冲液中（pH7.2-7.6），微波炉加热至沸腾后断电，间隔3分钟，反复一次，微波炉中放5分钟，然后放置室温，自然冷却后进行下一步；加正常山羊血清封闭液30min以消除背景非特异性染色，甩去多余液体，不洗；分别滴加