构建新型fgf及其对角膜及血管内皮细胞影响的实验分析

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特趴加以标注和致谢的地方舛，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：赫蚊签字日期：埘年％月啊日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和

2、借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名捌峻导师签名：籀确童签字日期：扣叮年旷月∥日签字日期：年月1日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：暨南太学博士学位论文(2005)中文摘要构建新型FBF及其对角膜及血管内皮细胞影响的实验研究博士研究生林媛导师徐锦堂教授副导师李校堑教授摘要角膜位于眼球的前部，易受外伤及炎症侵袭。掘统计，在致盲眼病中，角膜病占第

3、二位，丽眼外伤是单眼失明的重要因素之一；另外，随着内跟手术的增多，角膜内皮受损的机会增多，大泡性角膜病变也与日俱增，严重影响视功能。成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowzhfactor，FGF)对来源于中胚叶和神经外胚叶的多种类型细胞具有广泛生物学活性，其中aFGF(acidicFGF)和bFGF(basicFGF)是其主要成员，两者的分子结构相似，约有55％的氨基酸同源，是动物和人体中一种正常、含量甚微的多肽，一般以极低浓度存在于血清和体液中，通过自分泌和旁分泌而起作用。大量研究证明，bFGF有

4、促进角膜损伤修复的作用。从20世纪80年代至今，随着生物工程技术的发展，国内外己对bFGF进行了开发和临床应用。但是FGF作为广谱的促有丝分裂原，如果长期、大量使用，有诱发血管新生和肿瘤的风险。角膜是无血管透明的组织，其损伤修复是个复杂的过程，由多种细胞和细胞因子在时间和空间上高度协调而完成。角膜新生血管虽然对感染的消除、创伤愈合有一定作用，但其结构和功能并不完善，容易发生血浆渗漏，造成角膜水肿、脂质沉着以及继发性角膜瘢痕，严重影响视力。目前。FGF虽已应用于临床，对角膜损伤修复亦起了较好的作用，但其促新生血

5、管作用影响了它对某些角膜病的治疗。因此，人们对构建新型FGF寄予了很大希望。我们吸收国外经验，作了初步尝试，在体外细胞及动物实验中取得了比较满意的效果，为寻找一种理想的保护与修复角膜的药物提供了有益的资料。暨南大学博士学位论文《2005)中文摘要本课题对以下四个方面进行探讨。第一部分：利用分子生物学和基因工程方法对hbFOF的构型进行改造，得到一种具有生物活性、对血管内皮细胞促增殖作用减弱的改构hbFGF(modifiedhbFGF，m—hbFGF)。第二部分：体外实验观察m-hbFGF对3种角膜细胞的促增殖

6、效应。第三部分：探讨m-hbFGF对兔角膜损伤的修复作用及对新生血管的影响。第四部分：观察m-hbFGF在角膜内皮细胞中的转染表达及其表达产物对角膜内皮细胞的保护作用。第一部分：构建新型hbFGF的研究bFGF有确确的促进角膜损伤愈合的作用，但由于它是广谱的促有丝分裂源，对来源于中胚叶及神经外胚叶的多种细胞有促增殖作用，长期大量使用有促进角膜血管新生的可能。为了解决以上问题，我们采用分子生物学和基因工程方法，对hbFGF的构型进行改造，得到一种新型的hbFGF。一、新型改构体m-hbFGF的构建目的采用分子生

7、物学和基因工程方法对hbFGF的构型进行改造，得到一种新型的hbFGF改构体，表达出具有生物活性，对皿管内皮细胞促增殖作用减弱的m．hbFGF。方法1．m—hbFGFeDNA成熟肽基因的克隆和鉴定：将hbFGF基因序列中的第l19号赖氨酸定点突变。设置4条引物，进行PCR扩增，合成完整的m—hbFGFcDNA序列，并将其克隆至pUCl8载体中，形成m—hbFGF／pUCl8载体，转化D115d后进行DNA测序。2．m—hbFGF在大肠杆菌中的表达及鉴定：将m—hbFGF／pUCl8质粒中m—hbFGF基因克隆

8、至pET3C表达载体中，形成pET3C／m—hbFGF表达载体，转化于宿主菌大肠杆菌JMl09后进行双酶切和DNA自动测序鉴定，并筛选出具有高效表达的登南大学博士学位论文fz005)中文摘要pET3C／m-hbFGF／JMl09菌株。3．m—hbFGF重组蛋白分离纯化及其鉴定：将pET3C／m-hbFGF／JMl09菌株大量培养后，取对数生长期菌体制备全菌体蛋白。经超声波破碎后离心得到蛋白粗提物，然