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时间:2018-12-09
《nfκb诱骗性及反义寡核苷酸干预血管新生内膜的分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、NF-KB诱辅I佳反反义寡越营懿干霸f血瓣帝}生砖麟的研竞NF-KB诱骗性及反义寡核营酸予羲盘管藜生蠹膜的研究中文摘鬻【背景】冠心病的介入性治疗是心斑管病治疗学上次革命,但苒狭窄制约了介入术治疗心血管病的远期疗效。传统翡物预防和减轻再狭窄需超生理剂鬣运用,翁产生全身毒副作j=I{,难以在临床实际应用。棱骏药物的特异性定囱转送可以调控靶揍因的复制、转录、翻译等过程,在分子生物学治疗领域占据重溪地位。NF—KB是~种能调控多种熬因的、矮有多种效应的转泶因子,参与再狭窄众多病理生理过糕。【瞬的】探讨离体盎管平潜瓿缩稳帮动耪髂两转染转泶因子NF-1(:B;西5
2、诱骗寡挟蛰酸和反义寡核蝥羧辩平滑肌细胞增髓及大鼠颈动脉球囊损伤后衄管新生内膜的干预作用,为防治血管成形术后再狭窄提供新的思路和策略。【方法】采用贴块法原代培养大鼠胸主动脉
3、:缸管平滑肌细胞,实验选用3-5代血管平滑肌细胞。阳离予脂矮体分导的NF-KB诱骟性寡孩蛰酸、反义寡垓萤毅转染斑镑乎潺飘绷怒最,TNF一《蒯激平潺飘缁瑰增殖。建立火融颁动脉球囊损伤模型,阳离子脂质体介导NF-v.Bp65反义寡核酱酸、诱骗性寡核营酸局部定澎性转送至球囊损伤盔管蠹,福禽辩阗点采样逶孬磷究。【结果】离体研究结粜显示;①阳离子脂质体转染法将寡核茸酸导入平滑肌细胞12小时届,
4、转染效率最高。②寡核瞥酸/阳离子脂质体的比例为1:3时,细胞活性最佳。⑨下NF-d刺激平滑肌细胞赢,NF—KBp65表达增加,员囊抗谰亡俘绸,促避平潺魏绷腿增骧。④聂义寡垓萤酸、诱骗挫寒按萤酸W增强细胞早期凋亡,两组联合干预增强细胞凋亡作用较单独应用无明鼎统计学差异。⑤反义和诱骗性寡核莆酸均能抑制平滑蕊铀穗增疆,反义+诱骗骞核蛰酸联合干疆较蕈狻搜弱未鼹暴更臻鼹戆菝磺疆效应。免疫缀纯嚣}滚式细胞仪检测增碴的平滑肌细胞内增殖标记物PCNA表达增加,反义+诱骗寡桉瞥酸联台干预抑制PCNA表达的趋势鞍单独赢嗣明显。⑥原使杂交检测增殖匏平潜魏细藏浆、细胞拔内均有
5、NF—xBp65的基因袭达,反义寡核替酸抑制NF.KBp65表达,诱骗寡核管酸通过抑制NF-KBp65所调控的靶基因表达发挥作用。⑦RT.PCR、免疫组化和流式细胞仅检测TNF—n刺激的平滑臃细胞内1CAM-1、VCAM一1、MCP.1袭达丹赢。NF-女Bp65艇义和诱骗寡核营跛转染聪,ICAM*l、VCAM-l、MCP。1mRNA表达和赞白质合成减!:、,反义和诱骗寡核苷酸联合干预较单独使用抑制上述物质基因表NF—KB诱骗性及反义寡核苷酸干预血管新生内膜的研究达和蛋白质合成的趋势明显。在体研究结果显示:①大鼠颈动脉球囊损伤后第3天,正义组、诱骗对照组
6、、模型组中膜有平滑肌细胞增生,损伤内膜有增殖细胞。球囊损伤后5天、7天,正义组、诱骗对照组、模型组内膜面积、中膜面积、内膜/中膜比值较正常组、反义组、诱骗组、反义+诱骗组显著升高(P<0.05),7天后达到高峰。②反义组、诱骗组显著降低内膜与中膜比值,反义+诱骗组的内膜与中膜比值较反义组、诱骗组有更明显的降低趋势。⑧球囊损伤后的血管内膜、中膜、外膜均有细胞凋亡,N卜xB反义利诱骗寡核蕾酸可降低血管细胞凋亡。④RT—PCR显示正常组大鼠动脉均有ICAM.1、VCAM.1、MCP.ImRNA微弱表达,球囊损伤后6h,ICAM.1、VCAM.1、MCP.1m
7、RNA表达明显增加,球囊损伤后1天表达减少,3天、5天、7天ICAM.1、VCAM.1、MCP.1mRNA持续而明显的表达增强,14天后略为降低。反义组、诱骗组、反义+诱骗组在各时间点均能减少[CAM.1、VCAM-I、MCP-lmRNA表达。⑤免疫组化显示球囊损伤后血管PCNA、Brdu、IcAM一1、VCAM一1、MCP—i蛋白合成增加,PCNA、Brdu在损伤后第3天蛋白表达最明显。ICAM一1、VCAM一1、MCP-1蛋白合成在损伤后第7天最为明显。NF-KB反义和诱骗寡核苷酸干预可降低上述参数,两者联合作用降低上述物质蛋白合成较单独应用无统计
8、学差异。⑥原位杂交显示球囊损伤后血管中膜、新生内膜有NF—KBp65mRNA定位表达,在第3天时表达最强。反义组、反义+诱骗组干预后NF—KBp65表达减少,诱骗组无此效应。⑦WesternBlot检测球囊损伤后血管NF.KBp65、ERK2、MMP.9的蛋白合成。在正常颈动脉内,NF.rd3p65、ERK2、MMP.9有微弱的蛋白表达。球囊损伤后6h,ERK2、MMP.9的蛋白表达仍较弱,与正常组无明显差异,但NF-rJ3p65蛋白合成增强。1天后,ERK2、MMP.9蛋白表达略增强,NF.rd3的蛋白合成明显增强。球囊损伤后7天,D65、ERK2、
9、MMP.9的蛋白合成达到高峰。第14天,ERK2与p65的蛋白合成较第7天减弱,MMP-9的蛋
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