酪氨酸蛋白激酶lyn tec蛋白相互作用光激化学发光免疫分析试剂的研制

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1、硕士学位论文切相关，如该蛋白在Kaposi肉瘤中高表达，而与CD24相互作用可促进结直肠癌细胞的侵袭，该基因的缺失则降低Claudin-2在乳腺癌细胞中的表达，从而抑制乳腺癌的肝转移等。酪氨酸蛋白激酶Tee(Tyrosine．ProteinKinaseTee)属于非受体型酪氨酸蛋白激酶Tee家族，由PH结构域、SH3、SH2及激酶结构域组成，其N端缺乏疏水性跨膜结构，而C端缺乏负性调节区。酪氨酸蛋白激酶Tee蛋白主要在肝脏表达，尤其是人类肝细胞肝癌(Hcc)中表达异常高，与肝细胞增殖相关。Tee激酶介导T细胞信号传导通路，在T细胞活化扮演重

2、要角色，并且该基因与骨髓增生异常综合征有关。其存在于细胞质内，并在免疫细胞的发育、增殖、分化和凋亡中介导信号转导起到重要的生理功能。现有研究认为Tee激酶可通过与细胞内多种信号分子或PTK的相互作用，如Fyn、Lyn、P13K、Vav、PKB等形成不同复合物，在信号传递中发挥着不同的角色，可在受到Src家族蛋白激酶的激活后通过接头蛋白，激活Ras、Raf并发生级联反应。AlphaLISA技术应用于蛋白质相互作用研究具有极大的优势，代表了免疫分析检测技术未来发展趋势。本研究用双抗体夹心的方法研制酪氨酸蛋白激酶Lyn、Tee蛋白相互作用光激化学

3、发光免疫分析试剂。方法：1．酪氨酸蛋白激酶Lyn、Tec重组质粒构建及真核表达：提取人Hela细胞总RNA用RT．PCR方法获得目的基因，并分别克隆至携带His和Myc或Flag标签的pcDNA3．1(．)、pEnter真核表达载体。双酶切、PCR和测序的方法鉴定后，将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞，应用组氨酸标签镍离子螫合磁珠纯化融合蛋白，通过Westernblot检测蛋白的表达及纯化，并用CCK-8法检测Lyn激酶蛋白的表达对细胞的增殖能力的影响。2．酪氨酸蛋白激酶Tee多克隆抗体的制备及鉴定：在酪氨酸蛋白激酶Tee真核表达和纯化得

4、到His／Flag．Tee融合蛋白的基础上，将纯化的蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体，通过问接ELISA方法测定抗体的效价，Westernblot鉴定制备的抗体能特异地识别天然的蛋白等对所得抗体进行鉴定。III万方数据摘要3．受体微球与抗体连接：首先将30“g抗Tee抗体加入到含滤膜的30K截留柱离心管，40c8,0009离心6min，再用0．13mol／LpH8．0PBS缓冲液重复洗涤6次后加入以下试剂：200¨g受体微球、10¨l25mg／mlNaBH3CN(用上述缓冲液配制)和1．25LLl10％Tween．20，并用上

5、述缓冲液将总体积补充至200,1，放置于370C振荡孵育48h。加入10山65mg／mlCMO(0．8mol／LNaOH溶解)封闭未结合位点，370C振荡孵育1h，离心洗涤后调整已连接抗体的受体微球浓度为5mg／ml。4．生物素与抗体连接：首先将30嵋His标签抗体加入30K滤膜的离心管中，4。C8,000rpm离心6min。使用生物素标记液(含0．1％NaN3，0．1mol／LpH9．5Na2C03瓜aHC03)重复洗涤6次后，将总体积50肛l抗体溶液中加入3岭生物素中(DMSO溶解现配现用)后室温振动孵育4h。用带滤膜离心管去除多余未结

6、合生物素后将调整生物素化抗体浓度为0．5mg／ml。5．过表达蛋白细胞裂解液制备：采用转染试剂X．tremeGENEHP将每皿1099的重组质粒转染于10era培养皿的人肝癌HepG2细胞，转染48h后用预冷的PBS洗涤2次，每皿细胞用lml含1％(v／v)TritonX．100、1mmol／LPMSF的细胞裂解液重悬，冰上10min裂解后4。C14，000rpm离心30min，取上清备用。6．光激化学发光免疫分析：首先取出上述生物素化抗体溶液、受体微球化抗体溶液、过表达蛋白细胞裂解液或待测样品放置于室温平衡；再于Opfiplates微孔条

7、中依次加入受体微球化抗体、生物素化抗体、过表达蛋白细胞裂解液或待测样品，并贴上封片进行避光；放置在37。C恒温振荡仪上，微孔反应条振荡孵育30min；避光情况下，加链霉亲和素化供体微球175肛1；放置在37。C恒温振荡仪上，微孔反应条振荡孵育30min；使用2300EnSpireTM检测仪检测其信号值。7．免疫沉淀鉴定蛋白相互作用：用转染试剂将1099的重组质粒pcDNA3．1(．)．Lyn、pEnter．Tec转染10cm培养皿，转染48h后用每皿用lml细胞裂解液4。c裂解细胞，4。C14，000rpm离心30min，收集细胞上清分别加

8、入2mg抗Flag标签抗体，于垂直旋仪上40c反应过夜。取出每份409l的ProteinG填料，洗涤液洗涤3次，后加入至上述混合液，40C反应lh。将反应完的混合液IV万方数据硕