辣椒素合成酶capsaicinoidsynthetase基因的序列分析及对甜椒的遗传转化与功能验证

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1、华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密忝如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生张跷帆勾p6年‘月2『日学位论文使用授权书本人完全了解。华中农业大学关于

2、保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印．缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文．本人同意华中农业大学可叹用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全部或部分内容．蝴黼张磁摊名：脚注：保密学位论文在解密后适用于本授权书．，'签名日期：‰摩6月叫日签名日期：o瞳为年‘月卅日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问华中农业大学硕士毕业论文摘要辣椒素合成酶(CapsaicinoidSynt

3、hetase)基因的序列分析及对甜椒的遗传转化与功能验证摘要辣椒(Capsicumantzuum厶)是非常重要的蔬菜作物，具有很高的营养价值和经济价值。辣椒的主要辣味成分辣椒素(Capsaicin)具有多种药理与生理学活性，其含量是辣椒品质鉴定的重要指标之一。辣椒素合成酶(CapsaicinoidSynthetase)是辣椒素合成过程中的最后一个酶，也是关键性的限速酶。本研究通过农杆菌介导的遗传转化将编码该酶的C基因(即辣椒素合成酶基因)导入甜椒和辣椒品种，通过转化植株的表型分析探讨其是否具有使甜椒合成辣

4、椒素的功能，以期为高含量辣椒素的品种选育提供新的育种途径。通过对该基因表达的调控必将大大提高辣椒辣味程度及辣椒素含量的人为可调控性并有效改变辣椒食用品质，从而推动辣椒育种工作的发展。本研究获得的主要成果如下：I．以4个甜(辣)椒品种为试材，分别就无菌苗苗龄，不同辣椒基因型和外植体类型、培养基成份等对子叶离体再生的影响进行了较为系统深入的探讨，建立了辣椒子叶高效植株再生体系。(1)芽的诱导分化：以子叶为外植体，MS为基本培养基，对辣椒不定芽的诱导分化的研究结果为：16d苗龄的中椒5号和湘椒八号的子叶外植体的

5、再生率最高；分化培养基中添加10mg／LAgN03可有效避免外植体分化时期的褐化现象；分化培养基中生长素IAA对诱导芽分化的作用远高于NAA．筛选出子叶不定芽高效分化培养基：MB+6-BA5．0mg几+IAA1．0mg／L+AgN0310．0m鲫．一+蔗糖20盯，卜卡拉胶89／L，分化率达80％以上。(2)不定芽的伸长：激素组合为6-BA2．0mg／L，IAA0．3mg／L时不定芽生长最为旺盛，可基本满足芽正常生长对激素的需求；添加GA32．0mg／L时芽伸长效果最好；芽伸长阶段培养基硬度和三角瓶中的空气

6、湿度等环境条件的影响也很大，卡拉胶用量为69／L，采用塑料薄膜封口，可基本达到芽迅速伸长所需的环境条件。伸长效果明显。最终确定最佳不定芽伸长培养基为：MS+6．BA2．0mg／L+IAA0．3mg／L+蔗糖209／L+GA32．Omg／L。(3)生根：在辣椒芽的生根上，1／2MS培养基优于MS培养基，低浓度的IAA优于高浓度的IAA。最终确定最佳生根培养基为：1／2MS+NAA0．1mg／L+IAAO．2rag／L+,蔗,,糖209／L+卡拉胶8．0mg／L．从外植体接种到完整再生小苗获得，大约辣椒素合成

7、酶(Capsaicmoldbiosyntheta站)基因的序列分析及对甜椒的遗传转化与功能验证需要50-60天。2．以16d中椒5号和湘椒八号无菌茁子叶为外植体，在芽分化培养基上预培养2d，当农杆菌菌液的pH值为5．2，OD600为O．8时，浸染子叶15min，置于添加2001．tMAS的共培养基中在23℃黑暗条件下共培养2d，具有较高的转化效率。选择分化培养基中添加抑菌素Ticarcillin200mg／L可有效的抑制共培养后农杆菌的生长并不会对外植体的再生造成太大的影响，效果优于氨苄青霉素和羧苄青霉素

8、。菌液浸染外植体20天后调查出芽率，Kan浓度250mg／L时中椒5号和湘椒八号子叶外植体的分化被完全抑制，作为选择压。转化芽在含相同浓度的抑菌素和卡那霉素的伸长培养基中伸长至2～3cm时，移入含Ticarcillin150，Kan浓度175mg／L的选择生根培养基中生根，每14d继代一次。3．以中椒5号、湘椒八号，05RW21和04QR3四个辣椒品种的子叶为受体，以C基因为目的基因，应用根癌农杆菌介导法进行了遗传转化。通过卡