贯叶连翘中金丝桃素的酶辅助提取与微波辅助合成分析

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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。～张套岁匕覃帆川年多月夕日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同

2、媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：套矽邕，司时间：山，／年么月夕日导师签名：时间：矽，f年／月7日／中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目贯叶连翘中金丝桃素的酶辅助提取与微波辅助合成研究论文作者李兆周专业兽药学研究方向天然药物化学指导教师梁剑平培养单位(研究所、中心)兰州畜牧与兽药研究所硕(博)王雯慧教授博导甘肃农业大学基础兽医学‘＼．姓名职称单位专业签名导师阅柳纪省研究员博导中国农业科学院兰州临床兽医学＼．评吴润教授博导甘肃农业大学预防兽医学‘＼．兽医研究所人辩诎答主王建林教授博导兰州大学基础兽医学席桶司珧胡永浩教授硕导甘肃农业大学预防兽医学魏

3、锁成教授硕导西北民族大学临床兽医学瓢啦蚁杨志强研究员博导基础兽医学椭／答中国农业科学院兰州獬畜牧与兽药研究所辩中国农业科学院兰州张继瑜研究员博导基础兽医学畜牧与兽药研究所委中国农业科学院兰州劾∥妨郑继方研究员硕导中兽医学员畜牧与兽药研究所李剑勇研究员硕导中国农业科学院兰州基础兽医学钨I秀畜牧与兽药研究所硕导口博导口会议记录(秘书)周磊论文答辩时间地点．2011．05．31兰州畜牧与兽药研究所摘要金丝桃素是贯叶连翘中具有抗肿瘤和抗病毒活性的一种含量较低的萘骈二葸酮类化合物，目前所采用的提取方法存在很多不足，致使该化合物的提取率较低。本研究采用经电子束和重离子束辐照诱变的黑曲霉和绿色木霉所

4、分泌的纤维素酶作为植物细胞壁裂解剂，通过优化酶解条件提高该化合物的提取率，减少贯叶连翘资源的浪费。同时应用微波辅助合成的方法对金丝桃素的化学合成路线进行了优化，提高了反应的收率，降低了副产物的生成量。主要研究内容如下：(1)对黑曲霉GSICC60108和绿色木霉GSICC62010的产酶条件进行了优化，所得黑曲霉的最佳发酵工艺为：培养时间72h，接种量8．O％，培养温度28℃，初始pH值4．5，表面活性剂Tween-80的添加量为1．0％，最佳的碳源为稻草粉，最佳的氮源是以l：5的比例进行配比的硫酸铵和麸皮的混合物。绿色木霉的最佳培养温度35℃，初始pH值5．0，其余条件同黑曲霉。(2

5、)建立了产纤维素酶菌株的高通量筛选方法，采用刚果红．纤维素平板初筛和新建立的高通量微孔板法复筛进行突变体的筛选。所建复筛方法的回归方程为Y=0．208X+0．0006，标准曲线在0mg／mL．10mg／mL的浓度范围内线性较好，线性相关系数为0．99975。其精密度、重现性和稳定性均能够满足高通量筛选的要求。与国际通用的滤纸酶活力测定方法相比，测定结果无显著差异。(3)以黑曲霉GSICC60108和绿色木霉GSICC62010为初始菌株，对其单孢子悬液进行电子束辐照。黑曲霉和绿色木霉孢子的致死剂量分别为1000Gy和750Gy，且分别在750Gy和500Gy的辐照剂量下所得滤纸酶活力最

6、高，正突变率也为各剂量中最高，分别达到了12．0％和11．O％。对这两个剂量进行筛选后得到黑曲霉EBA105和绿色木霉EBT18两个突变株，其R值分别为3．9和3．5。黑曲霉EBA105的滤纸酶活力为152．5FPU／mL，纤维素内切酶活力为91．4IU，mL，纤维素外切酶活力为29．6IU／mL，B-葡萄糖苷酶活力为35．3IU／mL，较初始菌株提高了2．6倍．3．2倍。绿色木霉EBT18的滤纸酶活力、纤维素内切酶活力、纤维素外切酶活力和伊葡萄糖苷酶活力分别为186．9FPU／mL、108．2Iu，mL、61．3IU／mL和153．3IU／mL，较初始菌株提高了3．3倍．3．9倍。对

7、突变体纤维素酶基因的序列分析表明，辐照后的突变以点突变占多数。(4)为获得更高纤维素酶活力的突变体，采用12C针离子束对黑曲霉EBA105和绿色木霉EBT18进行了再次诱变，黑曲霉孢子的辐照致死剂量为150c3y，绿色木霉孢子为125Gy。黑曲霉和绿色木霉分别在80Gy和70Gy的辐照剂量下所得滤纸酶活力最高，正突变率也是各剂量中的最高值，分别为11．0％和16．O％。对这两个剂量进行筛选后得到黑曲霉CIA915和绿色木霉CIT626两个突变株