肝硬化在原发性肝癌的发生过程中所起作用的分子机制分析

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1、天津医科大学博士学位论文肝硬化在原发性肝癌的发生过程中所起作用的分子机制研究研究生：宋天强导师：郝希山、李强教授中文摘要原发性肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一，对人类的健康和生存构成了极大的危害。每年肝癌发病总数为56．4万人。肝癌发病占全球各种癌症的第五位，死亡占全癌死亡的第三位。在我国和某些亚非国家具有较高的发病率，我国肝癌约占全球肝癌的40％45％。由于我国是肝炎高发国家，近年来肝癌的发病率和死亡率有逐年升高的趋势，IARC2001年度报告，中国肝癌发病男性世界人口标化率(ASR)为35．17／10万，排位第三，仅次于肺癌和胃

2、癌；女性肝癌发病ASR为13．34／10万，排位第四，仅次于胃癌、乳腺癌、肺癌。肝癌死亡率男性为34．44／10万，女性为13．03／10万；肝癌死亡占所有癌症死亡的22．1％，超过肺癌，居第l位【2J。近年来的研究表明，肝癌的发生是多基因参与、多步骤改变的复杂过程，其分子调控机制仍未完全阐明。我国的肝癌患者多数都有乙型肝炎病史，然而大量乙肝感染而无肝硬化者，其肝癌发生率远远低于有肝炎后肝硬化者t3l，并且肝硬变在HCC中并发率达84．6％，而肝硬变后HCC发生率达49．9％¨]，因此提示多数情况下，HBV是通过肝炎后肝硬化发生

3、肝癌的。因此，检测硬化肝脏中原癌基因和抑癌基因表达状况，对发现肝癌发生前早期阶段的基因异常有着重要意义，并有助于揭示肝癌的发生机理。天津医科大学博士学位论文目前，国内外关于肝硬化在肝癌的发生过程中所起作用的研究少有报道¨‘61，多是针对个别己知的癌基因或抑癌基因，进行大规模差异基因的筛选并构建eDNA文库的未见有报道。本研究应用抑制消减杂交技术(SSH)，对肝硬化组织与正常肝组织差异表达基因进行筛选，构建差异表达基因的削减eDNA文库，并对部分克隆(70个)进行质粒酶切和PCR双重鉴定，并对其中16个阳性克隆进行基因序列分析、同

4、源性检索，为进一步研究肝硬化在肝癌发生发生过程中的作用奠定了分子水平的基础。第一部分伴肝细胞癌的肝硬化组织与正常肝组织差异表达基因的筛选目的：筛选伴肝细胞癌的肝硬化组织与正常肝组织差异表达基因。方法：采用抑制削减杂交技术，以3例正常肝组织及3例有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料分离出mRNA，经反转录成双链eDNA后，分成驱动子与检测子，将检测子连接上特定的接头，通过两轮不平衡杂交、两次PCR，筛选并扩增出两种组织间所有差异表达的基因。并进行了削减效率的验证。结果：mRNA提取检测、eDNA酶切消化检测、接头连接效率检测、PCR

5、削减效率检测均达到实验设计要求。结论：采用抑制削减杂交技术首次成功地分离出全部伴肝细胞癌的肝硬化组织与正常肝组织所有差异表达的基因。第二部分差异表达基因的cDNA文库的构建及差异表达基因的初步鉴定目的：构建差异表达基因的eDNA文库及初步筛选差异表达的基因方法：采用TOPOT／A克隆技术，将第一部分所得到的差异表达基因与TOPOT质粒载体连接，转化TOPl0大肠杆菌，构建含全部差异表达的基因eDNA文库。通过蓝白斑试验筛选出部分阳性重组子(70个)，天津医科大学博士学位论文进一步扩增，通过提取质粒进行酶切以及PCR法双重鉴定验证

6、重组子中插入了差异表达的基因。并进一步选择其中的16个阳性重组子进行序列测定，BLAST同源性检索。结果：质粒酶切以及PCR法双重鉴定验证了差异表达的基因成功的插入了重组子，cDNA文库构建成功。16个差异表达的基因序列测定，BLAST同源性检索显示，】个为载体序列，15个均在genebank中找到，有五对是相同基因，共10个不同的基因，涉及到Wilm’S肿瘤相关蛋白(QM)mRNA，载脂蛋白HmRNA，纤维蛋白原d链mRNA，甲胎蛋白mRNA，chromosome5cloneCTC．278H1，膜连蛋白V(ANX)gene，1

7、7．B羟类固醇脱氢酶IV型mRNA，核糖体蛋白L6mRNA，CGI．31蛋白mRNA，p53诱导蛋白PIGPCI结论：用ssH和T／A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库。该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌的发生过程中的相关的调控基因奠定了基础，也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用。对差异表达基因的初步筛选鉴定中发现，肝硬化阶段的确发生了基因的改变，涉及到的基因包括与肝组织密切相关的如：AFP、APort等，而且还有一些新近发现的和其他肿瘤相关的基因如：Wilm’s肿瘤相关蛋白，THW

8、基因等，以及一些在功能上仍不很明确的基因，如CGI．31proteinmRNA。进一步验证了肝癌的发生是多基因参与、多步骤改变的复杂过程。关键词：人肝癌肝硬化抑制削减杂交差异表达基因cDNA文库测序同源性分析天津医科大学博士学位论文StudyonMolecula