分子信标荧光探针用于遗传物质的超灵敏检测及超微型dna ph传感器的分析

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1、摘要／人们对生命现象的观察和研究已经深入到纳米尺度和单细胞，单分子的水平，如何L在这样一个尺度范围内获取有用的生物化学信息对分析化学的各个研究领域均提出了新的要求。单分子、单细胞检测、生物芯片的开发以及纳米技术的应用渐渐成为现代分析化学研究的主流领域之一。可进行实时、在线、原位、活体检测的分子探针和超微型生＼物传感器成为人们研究的热点和重点。力／”，＼户—一-一本论文紧跟上述前沿方I于开展了两方面的研究。第一部分主要是发展能特异性＼．／识别生物分子的分予信标荧光探针，建立准确、快速、定量检测遗传物质的新方法。如抑癌基因INGI在活体细胞内的转录产物的测定，以及病毒遗传

2、物质的快速检测；同时发展了分子探针的固定化方法，荠用于基因芯片的研究。第二部分在发展了sol-gel、光聚合法固定生物分子或荧光染料的基础上，成功地在超微型的光导纤维表面固定生物素化的分子信标以及氨基荧光素等荧光染料，制备了能用于单细胞测定的DNA、pH传感器，并成功地用于活体细胞中pH的测定，同时发展了能测定蛋白质、，葡萄糖等物质的生物传感器。／本论文各章内容可归纳如下：、第一章，根据抑癌基因INGl基因的序列设计并合成了检测矾G1转录产物的分子信标(5'--TAⅣ球A．C6．NH．CGTTGATGGTTCCACTTCTCGTGCGTTCAACG—DABCYL．3’

3、)，其中TAMRA代表四甲基罗丹明，为荧光基团，DABCYL代表4．(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸，为荧光熄灭基团。基于该分子信标，发展了一种快速测量从正常细胞系和鼻咽癌肿瘤细胞系提取的INGl转录产物的方法，所得结果与用逆转录结合PCR法(RT．PCR)得到的结果相吻合，使得原来需要2．3天才能完成的工作在1-2个小时内就能完成，并首次提出了将基因转录产物进行定量测定的方法。第二章，通过细胞转导实验证明，针对INGl转录产物设计的分子信标荧光探针能通过脂质体转导的方法转入活体细胞中，在细胞核和一些细胞器的周围发出荧光显示INGl转录产物的存在；实现在单细胞水平上观察IN

4、Gl转录产物在细胞质中的表达和分布。并且，将能表达INGl基因的质粒转入肿瘤细胞进行培养后，再将分子信标转入肿瘤细胞，发现转导了质粒的肿瘤细胞比没转导质粒的肿瘤细胞内的荧光明显增强，其增强程度可用光谱扫描的方式将其量化。第三章，根据一种常见的病毒烟草花叶病毒(TMV)的核酸序列设计了分子信标荧光探针，由于TMV的遗传物质是RNA，分子信标又具有很高的特异性和灵敏度，因此感染了病毒粒子的植物叶片在经过简单处理后，可用分子信标检测叶片上感染病毒的程度。这样既避免了病毒粒子复杂的提取过程，又节省了PT-PCR扩增过程和琼脂糖凝胶电泳所需要的大量时间。第四章，根据人体肌动蛋I

5、刍13-actin基因的序列合成了分子信标并将其生物素化，发展了桥式结构固定分子信标的方法，结果表明这种方法可以有效地分子信标，以此构造了DNA生物传感器。传感器对eDNA的响应时间为15分钟，并对单碱基突变的DNA具有很高的选择性。采用激光激发和荧光显微镜收集信号后，传感器的检测限可达10。mol／L的水平。这种方法可用来建立基于分子信标的单基因DNA芯片检测技术。选取了乙型肝炎病毒(HBV)为检测对象，根据其高度保守的基因序列设计相应的分子信标。这种探针对乙肝病毒阳性和阴性病人血清的检测有显著性差异，生物素化的分子信标可以用桥式结构固定在玻璃片表面，制成DNA芯片

6、，根据芯片的荧光可以快速检测到靶DNA的存在。第五章，研究了溶胶-凝胶法固定生物分子的新方法，使用了一种新的制备和保存方法使得溶胶一凝胶敏感膜透明且无破裂。利用透射电子显微镜分析了酶分子在溶胶．凝胶中的存在状态，发现酶分子在溶胶．凝胶中象在水溶液中一样均匀分布，且不影响活性。辣根过氧化物酶(圈婶)和葡萄糖氧化酶(GOD)都能成功地包埋于其中。利用此方法，我们构造了一种基于鲁米诺一H202-HRP体系的化学发光信号型过氧化氢传感器，化学发光的强度与过氧化氢的浓度在O．01—2mlvl之间有线性响应，检测下限达8uM，与共价交联的固定方法相比，此传感器具有较长的寿命和较好

7、的稳定性。此传感器可用于分析葡萄糖和酚类物质的含量，并发现对酚类物质的响应是通过竞争反应实现的。第六章，研究了基于溶胶．凝胶固定化方法的DNA生物传感器，建立了溶胶．凝胶法固定分子信标的模型，提出了利用桥式结构固定分子信标的最佳方案，然后将分子信标固定在光导纤维和亚微米光纤((p0．8pm)的表面，制得了以溶胶．凝胶敏感层为基质的超微型DNA生物传感器。在采用了包括荧光显微镜在内的高效光学成像系统后，此传感器的检测范围为0．5．50raM，检测下限达0．2nM。在进行实际测量时，试样的体积仅为0．8vL，经计算，该传感器可以检测到8x1015tool