β地中海贫血的新突变鉴定和高通量突变检测方法分析

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1、博士学位论文13地中海贫血的新突变鉴定和高通量突变检测方法研究博士研究生：莫秋华指导教师：徐湘民教授摘要13地中海贫血(简称13地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一。B地贫在全球许多地区具有很高的发生率，目前已得到公认的原因是由于疟疾选择的结果。因此地贫主要分布在疟疾高发的热带亚热带地区，从地中海沿岸和非洲大部分地区到中东、印度次大陆、中国南方、东南亚、并延伸至印度尼西亚和太平洋地区，而美国、中美和南美等国因移民原因也成为高发地区。由于重型B地贫是致死性疾病，患者需要定期输血和去铁治疗以维持生命，因此，13地贫仍是这些地区最棘手的公共健康

2、问题之一。对于一个地贫高发的社区或国家而言，控制该病的最有效途径是在遗传流行病学研究的基础上制订预防计划，通过实施大人群的筛查和高风险夫妇的产前诊断来防止重症患几的出生。O地贫是我国长江以南各省区高发的血液遗传病，广东、广西、海南、江西、台湾和香港等地尤为突出，受累的人口达2亿以上。本研究试图在13地贫的人群分子流行病学调查和／或临床实践中，发现新的6地贫致病基因并阐明其遗传学基础。此外，利用国际最新基因突变检测技术平台，建立适于中国人的高通量自动化p地贫常见突变检测技术。研究结果能为我国p地贫的遗传咨询、产前诊断和实施大人群的预防计划提供

3、有价值的遗传学资料和筛查方法。一、一种新的80地贫基因的鉴定13地贫是由于p．珠蛋白基因突变导致p．珠蛋白肽链缺女N(fl。)或合成不足(D+)而引起的遗传性溶血性贫血病，为常染色体隐性遗传病。B地贫的分子病理具有高度的异质性，主要为“号染色体上B一珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。目前全世界已报道的基因突变类型达200多种，每个种族人群有其自身的常见突变类型。在我国人群中，截止现在，已发现的B地贫突变类型有33种之多。．1摘要这些突变从对基因的功能影响来说，主要分为导致转录降低、转录后修饰(即RNA加工)错误和翻译错误等三种类型。影响翻译

4、的突变有起始密码子突变、无义突变和移码突变。移码突变是D．珠蛋白基因变异的常见类型，它通常在其3’端下游产生一个提前的终止密码子(prematureterminationcodon，PTC)，PTC的出现使翻译过程中蛋白质的合成提前终止，产生了原羧基端片段缺失的、长度更短的、没有活性，即无功能的截短多肽片段。这种突变引起的表型通常是fIU地贫，如中国人的常见突变CDs41／42(一TCTT)、CDs71／72(+A)矛I]CDs27／28(+C)以及少见突变CDsl4／15(+G)等，均引起Bo地贫。本研究在一个祖籍广州的中国人家庭通过系统

5、的血液学表型分析和直接DNA序列测定，发现了一种新的移码突变一B．珠蛋白基因密码子15和16位之间+G的插入突变，即CDs15／16，+G；TGGGGC—÷TGGGGGC。先证者为2岁零8个月的女婴，f临床诊断为输血依赖的重症p地贫患儿。通过红细胞参数和血红蛋白电泳等血液学表型分析，证实先证者的父亲、母亲和外祖父三人呈典型的小细胞低色素改变，即MEV和MCH均降低，分别是：68．9fL／22．1pg，56．4fL／19．Opg，59．1fL／19．9pg，并且HbA2升高(均>3．5％)，属p地贫杂合子(携带者)表型。在表型数据支持为13地

6、贫的前提下我们在DNA水平对先证者家系进行了中国人D地贫24种突变的筛查，采用的基因分型方法是聚合酶链反应(PolymeraseChinReaction，PCR)结合反向点杂交(ReverseDotBlot，RDB)技术。PCR，RDB法检出先证者及其父亲携带有启动子区转录突变．28(A_G)，但并未检测到先证者母亲的突变基因。所以，先证者的另一个致病基因无法确定，RDB的结果提示可能有未知突变存在。因此，我们通过PCR反应扩增先证者B．珠蛋白基因全长片段并对PCR产物进行直接DNA测序分析，结果显示先证者另一条染色体的p．珠蛋白基因外显子

7、1(Exon1)内的突变热点区第15位和16位密码子之间插入一个鸟嘌呤核苷酸“GMP”，即移码突变CDsl5／16(+G)，并且碱基G的插入导致在其下游第22位产生一个PTC(提前的终止密码子)—TGA。DNA反向测序和先证者母亲及外祖父的p一珠蛋白基因局部测序进一步验证了该插入突变。经文献检索和珠蛋白基因服务网站(http：／／globin．cse．psu．edu／)的“人类血红蛋白变异和地贫突变的在线数据库”查询，证实此PTC移码突变--CDsl5／16(+G)是未见报道的p地贫新突变类型。简言之，先证者为一p地贫双重突变杂合子，2条染

8、色体上p．珠蛋白基因的缺陷分别是：．28(A_G)转录突变，遗传自其父亲；CDsl5／16(+G)移码突变，源自其母亲，并由其外祖父传递而来。可见，该家系地贫基因的遗传方式属典型