突变和多态的分析

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1、常用的基因突变和多态分析技术各种检测突变方法的相对灵明度MorphologyLowSensitivity5%ImmunophenotypingLacksSpecificity1-5%SouthernblottingLabourintensiveSlow1%CytogeneticsLabourintensiveSlowMetaphasechromosomes1%FISHLabourintensiveInterphasechromosomesHighqualitychromosomes0.3-0.5%PCRamplificationDNAsequencerequired0.001%基因突变与

2、检测方法的选用基因异常方法探针、引物或限制酶基因缺失Southern杂交缺失基因的探针PCR分析引物包括缺失或在缺失部位内点突变RFLP分析突变导致其切点消失的限制酶ASO杂交正常和异常的ASO探针PCR分析引物包括突变部位（RFLP,SSCP)基因已知但异常不明基因内或旁侧序列基因内或旁侧序列探针或引物多态性（RFLP,AMP-FLP)连锁分析基因未知与疾病连锁的多态性，与疾病连锁的多态位点探如AMP-FLP连锁分析针或引物RFLP位点单体型连锁分析等位基因特异的寡核苷酸探针诊断当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成标记32P的等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-speci

3、ficoligonucleotide,ASO）来进行诊断。探针通常为20个碱基左右的核苷酸包括了突变位点在内。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与正常基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。这样，使当地调整杂交条件，使只有探针与待测DNA完全一致时才能稳定地杂交结合。就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。Addradio-labelednormalDNAprobesAmplifyDNAandhybridizetomembranesAlleleSpecificOligon

4、ucleotide(ASO)HybridizationAddknownmutantDNAprobesPatients#1#2#3#1#2#3ααα10kb4kb↑BamHⅠ↑BamHⅠ↑↑5′3′5′3′(α)5′3′(--)αα/αααα/--αα/α-α-/----/--14kb10kbα地贫基因缺失的诊断左图示16染色体上携带有数目不同的基因，箭头示BamHI的切点；由图为用α基因探针杂交的结果。缺失的检测外显子bpNP←Pm53534104335750271132386202471816013952113DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者(P)有电泳带的缺失

5、。Pm为启动子荧光原位杂交（FISH）基因组探针的分离利用原位杂交的方法进行基因定位IVS-ⅠIVS-Ⅱ↓↓↓MstⅡ部位↓1.15kb1.15kb1.35kb正常1.15kb镰变1.35kb正常镰状性状镰状贫血1.15kb1.35kb镰状贫血的基因诊断LinkageAnalysisLooksforpatternofDNAmarkersneargeneofinterestthatsegregatewithdiseaseRequiresDNAanalysisofmultiplefamilymembers1,23,41,31,42,32,41234ⅠⅡ1212345kb5.73.42.3成人

6、型多囊肾病的连锁分析单链构象多态性诊断法单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异。这种差异将是相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于靶序列DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。用SSCP法检测基因的点突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无突变或多态性的优点，

7、但如与阐明突变的碱基性质，则需作进一步的序列分析。SingleStrandConformationalPolymorphism(SSCP)DNAGelNormalMutatedmutationDNAisdenaturedintosinglestrandsSinglestrandsfold;shapeisalteredbymutationsMobilityofmutantandnormalstrandsdifferingelProte