细胞凋亡实验

《细胞凋亡实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、细胞凋亡的检测原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、闪质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被乔噬细胞乔噬消化。在凋亡过程中细胞內容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学

2、上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder(梯状带纹)的特征。而细胞坏死吋，DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”(smearladders)条带。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱(HT)是我国0行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等宥良好

3、疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02〜5(ig/ml范围内作用2小时，即口J*诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用ljig/mlHT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同吋，也奋少数细胞发生坏死。川Hoechst33342和碘化内啦(propidiumiodide,PI)对细胞进行双重染色，可以IX别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而-•些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因

4、而可进行活细胞染色。恥^1^33342是~种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。再进一步用DNALadder测定观察细胞凋亡情况。试剂三尖杉酯碱（HT）,300gg/ml,PI母液：500

5、ig/ml,Ho33342母液:2mmol/L。溶解缓冲液（含50mMTris、10mMEDTA、0.5%肌氨酸钠、0.25mg/ml蛋白酶K）50ml,取1MTris-HClPH8.02.5ml、500mMEDTAPH8.01ml、10%肌氨酸钠（先水浴溶解）2.5ml

6、、lmg/ml蛋白酶K12.5ml、SDW31.5ml0TBE电泳缓冲液：（含90mMTris、90mM硼酸、2mMEDTA）1000ml,取1MTris-HClPH8.090ml、0.5MEDTAPH8.04ml、0.45M硼酸200ml、SDW706ml。仪器设备荧光显微镜、载玻片、盖玻片、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统。实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37°C,5%CO2条件下培养。方法1.三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37°C,5%CO2培

7、养箱培养。2）实验前约2.5小吋，当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200pl，使终浓度为lpg/ml,②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小吋。2.HO33342和PI双重染色鉴別三种细胞1）染色：将瓶中的细胞摇匀，取200pl于1.5ml的离心管屮，加入Ho33342母液2）il，PI20^1,染色15分钟。2）滴片：取一载玻片，用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10Ml,加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察,区别三种细胞，并注意三者比例。注意1）.诱导培养HL-60细胞时间耍准确。2.

8、）荧光显微镜卜*观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时耍尽量快。3.DNALadder测定1）收集2X106细胞（诱导凋亡细胞）离心沉淀，力叩.5ml溶解缓冲液（视细胞量加减量）混匀，置5（rc孵育1小时。2）加RNaseA（0.15mg/ml）于50°C孵育1小时。3）加10ul10mMEDTA（含1%低熔点琼脂糖）4）于70°C加热后，加入1.2%琼脂糖中，电压40V电泳1.5小吋（电泳缓冲液用TBE）。5）电泳结朿后于凝胶成像分析仪照相分析结果。