实验八卵母细胞的体外培养

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1、实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。应川乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射0.3ml/只）等麻醉后，再按外科手

2、术要求打开腹腔。将母兔背朝下方固定于兔手术台上。在兔腹部最后两对乳头的腹屮线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。然后盖上创巾并固定。用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2〜3cm长的术LI，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪來扩大剪口。打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。仔细观察卵巢的变化。记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替0.5ml）

3、，把针头插入卵泡中吸去収卵母细胞。从卵巢巾获得的卵母细胞力什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数笫二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也己经完成受精了。人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte):在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。(二)卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M

4、199。使用时需添加一定浓度的血清、促性腺激素和雌激素等。2、培养方法卵母细胞体外培养一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。(1)微滴法先将成熟培养液在组织培养皿中做成50-100u1的微滴并覆盖石蜡油，然后将5—10枚卵母细胞放入其中培养。如培养单个卵母细胞，则制备10ul的微滴。此法适用于多组对比试验，或来源于不同母畜的卵母细胞的分别培养等。(2)封闭法先将卵母细胞放入盛有2—3u1成熟培养液的15u1试管中，用胶塞密封试管口并在胶塞上插入一注射针头，然后从针头充入含有5%C02的空气，充气完毕后将针头拔出。(3)开放法先将1-2ul成熟

5、培养液放入培养皿中，然后将含有卵母细胞的表面皿置于恒温的含有5%C02空气，的培养箱中培养。牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为38—39'C,人和齿类动物为37'C。所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5%C02的空气和最大湿度的环境。牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22-24h,而马为30—36h，。猪为40—44ho(三)观察步骤将盛有卵子保存液的表面皿罝10倍镜下检查，找到卵子后用吸管(先将吸管挤出少fi气体后，对准卵子吸入)吸取卵子，放入凹载玻片的凹窝内，用钢笔在载玻片背而将卵子划一圆圈，賈1

6、00倍显微镜下，观察卵子的形态，或在变倍显微镜下直接观察。1、观察正常卵子形态动物的卵子多呈圆球形，闪含有一个球形核，核内有1一2个核仁，细胞质含量丰富，其屮贮存有卵物质，和一般生物细胞一样也含有线粒体和内网器，细胞膜很薄，通常称为卵黄膜。动物的卵子，卵黄含量较少且分布均匀，故属少黄均质卵黄，排出卵子的大小，直径变动在80-200pm之间,如马为120—180pm,牛为120—160^m,绵羊为140—185pm,猪为120—170pm，实验动物海豚鼠为87—107pm,兔为110—146pm。因动物种类不同，卵细胞质A所含卵黄素颗粒和脂滴

7、的:W:不同，因此卵的外观也有差异。如山羊、绵羊、兔的卵子卵黄颗粒细，分布均匀，脂滴含U少，因而细胞较明亮，而马、牛和猪的卵子所含脂滴量多，其折光性强，因而细胞质呈黑块状，但也有人认为屮的脂滴含不多，卵细胞质不如马和猪的深。动物新排出的卵子，在卵黄膜外，还具有透明带和放射冠两种结构。透明带由卵泡上皮分泌而来，包在卵黄膜外，卵在进行第一次成熟分裂之后，排出第一极体，卵细胞质收缩，于是在卵黄膜和透明带之间出现了一个很小的裂隙，称卵周隙或围卵腔，如卵继续进行第二次成熟分裂，则排出第二极体，两者均存在于卵周隙屮。细胞质进一步收缩，卵黄周隙就进一步扩

8、大。透明带是一种透明、均质的半透性膜。属粘多糖蛋白，含有透明质酸，它有弹性，用针很难刺入。卵子受精后，在卵裂、桑椹胎和囊胚早期，透明带明显，它可作为输送营养的通路,并对卵子和幼嫩