自制脂质体包裹米尔法兰通过血脑屏障的研究

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1、自制脂质体包裹米尔法兰通过血脑屏障的研究TheresearchofMelphalanpackedwithliposomecrossingtheblood-brainbarrier实验目的利用SPECT分析和ELISA法比较Melphalan—辅料脂质体a、Melphalan—普通脂质体b和单纯Melphalan等在脑内分布的百分数和循环时间，评价脂质体对米尔法兰包裹后促进其通过血脑屏障的作用。米尔法兰(Melphalan)可有效地治疗多发性骨髓瘤、乳腺癌和子宫癌等。但是，由于其与血脑屏障中性氨基酸载体亲和力很低,故全身用药后CNS内的浓度较低

2、。脂质体的主要成分是磷脂和胆固醇，磷脂分子中含有亲水的极性头基和疏水尾基;胆同醇与磷脂混合后，可以改变磷脂膜的变相温度，从而影响膜的通透性和流动性。由于这种典型的双亲分子特性，使脂质体具有亲水亲油性，可以作为大分子药物跨膜转运的载体。本研究用脂质体包裹米尔法兰，且在脂质体屮添加了各种辅料,制备出具有脑组织靶向性的脂质体，并对其通过血脑屏障的作用进行研究。实验内容1.1仪器装置及试剂1.1.1仪器装置：85—1恒温磁力搅拌仪；FJ-391A1型活度仪；SPECT；450nm酶标仪。1.1.2试剂："mTc-Melphalan；脂质体;Melph

3、alan；EIA试剂盒。1.1.3实验动物：健康新西兰兔3月龄(45只)，普通级，雌雄各半，体重(2.0±0.2)kgo将试验用兔以卢戈液口服，每次5滴，每日3次，同时，在大腿内侧涂搽碘酊，每口3次，用来封闭甲状腺及脉络-从，减少试验误差。麻醉成功后将新西兰兔15只随机分成以下3组：①4.OmCi"niTc—Melphalan(0.05mg/kg,5只)；②4.0mCi"niTc-Melphalan—脂质体A(0.05mg/kg,5只)；③4.0rnCi"mTc-Melphalan—普通脂质体B(0.05mg/kg,5只)；各组均分别由耳缘静

4、脉注入分别含有"niTc4.OmCi样本，用以进行SPECT检测。另将穿刺脑脊液成功后兔随机分成4组，每组7只。分别由耳缘静脉注入单纯Melphalan、脂质体包裹的Melphalan.单纯脂质体和生理盐水，用以进行脑脊液采集。1.2实验方案1.2.1"mTc-Melphalan一脂质体的制备将自制脂质体A、B各10mL分别倒人20mL小烧杯中，其内各加人°加Tc—Melphalan2.0mL（含9加口24mCi）,以封口膜密封，在4°C冰箱内、磁力搅拌器（60r/min）上持续搅拌30min即得，并测定其放射性计数。1.2.2"mTc-Me

5、lphalan一脂质体生物学活性测定生物学活性以7〜9日龄鸡胚DRG鉴定，方法见文献［2］。1.2.3SPECT测定当1、2、3、4h时，对给药后的各组实验用兔进行SPECT照相（前后位），比较3组药物静脉注射后脑组织靶向性和体内分布情况，测定3组标本于1、2、3、4h时脑部及全身放射性强度，并计算出两者Z间的比值R（R=Cntc.ofbrain/Cntc.ofallXlOO%）。1.2.4脑脊液采集将麻醉后兔置于立体定位仪上，于枕骨隆突初剪毛，消毒手术野，切开皮肤及皮下组织，显露颅骨，屈曲颅脑。以牙科钻斜45°方向向下刺人达枕骨大孔处，以腰

6、麻管置管，并抽出清亮脑脊液120uL于Eppendorf^屮。分别由耳缘静脉注入上述分组标本后，于给药30、60>90>120min吋段抽取脑脊液120uL于Eppendorf管中。将Eppendorf管编号备用。1.2.5ELISA检测将标准品稀释到250.000,125.000,62.500,31.250,15.625,0pg/mL与样品分别加100uL于各孔中。密封板并于37°C孵育60mino通过颠倒孔清除孔内容物,加入250uL稀释缓冲液，清除并重复5次，通过倒置于可吸收组织除去多余缓冲液（在进行下一步之前）。加入100uL生物素密

7、封板并于37°C孵育60mino冲洗5次,加入100HRP密封板并于37°C孵育30mino冲洗5次，加入lOOuLTMB底物，密封板并于37°C孵育（20土10）min（避光）。加入100uL终止液。混匀30s,在30min内于A=450nm的酶标仪上读各孔A值。制备标准曲线。根据标准曲线计算脑脊液屮Melphalan浓度。考察指标、检测方法及意义1.1SPECT实验结果考察指标：SPECT显影、脑部的放射性计数占全身放射性计数的比率R二Cntc.ofbrain/Cntc.ofallX100%检测方法：SPECT照相（前后位）、放射性活度计

8、测定放射性计数意义：可比较Melphalan—脂质体、单纯Melphalan和Melphalan—普通脂质体在体内的分布及脑部的放射性计数与全身的放射性计数比值的差