包裹nr2b重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析

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1、包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析【关键词】NR2B免疫脂质体特征　　脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体,可以延长包裹物的作用时间、降低毒性,具有一定的靶向性[1,2]。免疫脂质体则是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体,具有主动靶向的功能[3,4],为抗肿瘤和基因治疗提供了新的思路[5]。本研究中采用逆相蒸发法将真核表达质粒pcDNA3.1NR2B有效地包封在脂质体中,形成纳米级颗粒,并且与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体（mAbOX26）相连,形成免疫脂质体,并对其形态结构、粒径、包封率、及偶联抗体的分布和数目进行

2、了初步检测。　　1材料和方法　　1.1材料pcDNA3.1NR2B重组质粒由本室保存;POPC(1palmitoyl2oleoylsnglycerol3phosphocholine)、Distearoylphosphatidylethanolamine(DSPE)PEG2000、DSPEPEG2000maleimide购自Avanti公司;DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)购自Fluka公司;薄膜挤出器购自Avestin公司;旋转蒸发仪购自巩义予华公司;SepharoseCL4B为Pharmaci

3、a公司产品;限制性内切酶购自Fermentas公司;质粒小量提取试剂盒购自VGENE公司;DNaseI和exonucleaseIII购自TaKaRa公司;质粒大量提取试剂由孙怀昌教授馈赠;其他试剂为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒pcDNA3.1NR2B的扩增制备用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA,经BamHI酶切鉴定。将菌种大量培养,大量提取质粒DNA。经10g/L琼脂糖电泳检测其纯度,并用紫外分光光度计测定其A260/A280值,根据A260/A280比值估算其纯度,根据公式DNA浓度=A260×50mg/L×稀释倍数,计算其质量浓度。　

4、　1.2.2免疫脂质体的合成及抗体的偶联采用逆相蒸发法将POPC、DDAB、DSPEPEG2000及DSPEPEG2000maleimide按一定比例溶解于氯仿中,用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂,置水浴超声波仪处理5min,加入一定量质粒DNA在42℃水浴和干冰中反复冻融,并连续几次通过100nm薄膜挤出器,未包裹入脂质体的质粒用DNaseI和exonucleaseIII37℃作用1h,EDTA终止反应,琼脂糖CL4B柱分离包裹质粒DNA的脂质体和被核酸酶降解的DNA,琼脂糖凝胶电泳检测。mAbOX26经修饰巯基化后与包裹质粒DNA的脂质体室温下轻摇连接过

5、夜,再次用琼脂糖CL4B柱分离未连接的抗体和免疫脂质体。　　1.2.3脂质体的形态结构和粒径观察取适量脂质体用3g/L磷钨酸负染,再滴至专用铜网上,自然风干,用透射电子显微镜观察脂质体的形态结构和大小。　　1.2.4免疫脂质体的特征分析将收集到的未连接的抗体和免疫脂质体分别包被板子,以HRP标记的羊抗小鼠IgG为一抗做直接ELISA实验,以确定免疫脂质体是否已连接上抗体;用5g/LSDS破坏免疫脂质体的膜表面结构,对其释放内部包裹的物质进行琼脂糖凝胶电泳观察;同时将免疫脂质体与10nm胶体金标记的抗小鼠IgG在0.018mol/LTrisCL（pH＝8）,3

6、g/LBSA,170mL/L甘油缓冲液中孵育1h,直接在透射电子显微镜下观察,通过与mAbOX26特异性结合的抗小鼠IgG上胶体金的显色,间接确定免疫脂质体上连接的抗体数目和分布。　　2结果　　2.1质粒DNA的提取小量提取的pcDNA3.1NR2B质粒经酶切电泳鉴定其相对分子质量(Mr)约为9800bp,与预计相符。大量提取的质粒DNA经电泳和紫外分光光度计测定,其质量浓度约1.2g/L,A260/A280比值约为1.89,表明提取的质粒DNA纯度较高。　　2.2透射电镜观察脂质体的形态结构及粒径分布由透射电镜照片可见,制备的脂质体为粒径均匀的球状或近球状的

7、小囊泡;粒径分布范围从30nm至150nm,平均粒径低于100nm（图1）。　　图1脂质体的电镜图（×100000）（略）　　2.3脂质体琼脂糖凝胶电泳分析将相同质量的质粒,经反复冻融的脂质体,通过100nm薄膜挤出器的脂质体以及经核酸酶消化的脂质体同时置于5g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察。经过DNaseI和exonucleaseIII处理,未包裹入的DNA已被分解,而脂质体能够抵抗核酸酶的降解。　　同时通过Gelproanalyzer4.0software软件比较凝胶图中DNA的条带亮度,可以较为准确地算出总DNA量和未包裹入脂质体的DNA量（图2）,根

8、据包封率=［（总DNA量