生物实验4实时定量pcr实验报告

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1、实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实吋荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料realtimePCR仪（ABI7500,RotorGene3000）,微量移液器，Ti

2、p头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBRMix,引物及108copy/ul标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记IO?,106,105,104,向每管加入90P1ddH2O,取10ul108copy/ul的标样加入到IO?管屮，充分混匀后，从管中取10U1107copy/ul的液体到咐管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。2、配制预混液:取119卩1ddH2O>7u1引物4204f、7u1引物4448r和

3、7u1Rox到装有175U1SYBRMix液的1.5ml离心管中,混匀。3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记10*、心、1（?、1010UNK（未知样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42U1预混液和4.7U1模板（1・5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O）,混匀。4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20J至第1・7管中（第8管空岀），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。5、设置分析仪参数如下：95°C3min；95°C15s+60°C40s为一

4、个循环，循环次数40,融解曲线温度范围60〜95°C。振荡好的样品进机进行PCR扩增。6、扩增后利用软件分析Ct值及未知样的定量结果。五、实验结果与讨论1、实验结果如何？试分析。答：实验结果及分析如下。(1)、实验具体数据见下表QuantityCtWellTaskCtCtMeanCtSDQuantityMeanQuantitySDThresholdA1STANDARD8.24888.25270.00551000000000.0712A2STANDARD8.25658.25270.0055100000000

5、0.0712B1STANDARD11.389311.65980.3825100000000.0712B2STANDARD11.930311.65980.3825100000000.0712C1STANDARD15.329214.96680.512610000000.0712C2STANDARD14.604314.96680.512610000000.0712D1STANDARD19.491219.30800.25901000000.0712D2STANDARD19.124919.30800.2590100

6、0000.0712E1STANDARD22.538522.41960.1681100000.0712E2STANDARD22.300722.41960.1681100000.0712F1UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.6250.0712F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.6250.0712G1NTC32.53290.0712G2NTC32.95490.0712其中，A・E为标

7、准样晶，F为位置样品，G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83X107o(2)、扩增曲线从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。(3)、标准曲线StandardCurveF・lllt@lt-嘗MfllMg13121110081000100001COOOO1000003UXJUXi100X)00)01000000Quantity-CogarKl

8、Standard■Unknown3Unknown(Flagged)R2=0.996Eff%=89

9、.638从标准曲线屮可以看出，2值较好，标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其中106和107的两个平行样的CT偏差较大，这一现象可以从(1)表中看出，其SD分别为0.5126和0.3825,相比其他点较大，一般认为SD大于0.5不理想。(4)、融解曲线h/loltCurve0.060.03—二■-I=——.——―OS.O・・・♦70O73.Ooo.OTrr»：05DO.o0.019STemper(*C)ABMo■■OIMEFM