生物实验4 实时定量PCR 实验报告.doc

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1、实验四定量PCR扩增姓名:李宗翰专业:环境工程学号:1432999同组人姓名:刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理,熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料realtimePCR仪(ABI7500,RotorGene3000),微量移液器,Tip头,0.2ml光学薄壁管,8联PCR管,1.5ml离心管,SYBRMix,引物及1

2、08copy/ul标准品四、实验步骤1、标准样品稀释:取4个1.5ml的离心管,写上标记107,106,105,104,向每管加入90μlddH2O,取10μl108copy/ul的标样加入到107管中,充分混匀后,从管中取10μl107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释,得到5个倍数的标准样品。注意,每次稀释都要换Tip头。2、配制预混液:取119μlddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μlRox到装有175μlSYBRMix液的1.5ml离心管中,混匀。3、分装预混液:取7个小离心管,分别标记108、107、106、105、104、UNK(未知

3、样)、NTC(阴性对照)。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板(1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O),混匀。4、戴上手套取两个8联管,并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中(第8管空出),每个样品两个重复,共14个样品。将加好样的8联管振荡。5、设置分析仪参数如下:95℃3min;95℃15s+60℃40s为一个循环,循环次数40,融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。6、扩增后利用软件分析CT值及未知样的定量结果。五、实验结果与讨论1、实验结果如何?试分析。答:实验结果及分析如下。(1)、实验具体数据见下表WellTaskC

4、тCтMeanCтSDQuantityQuantityMeanQuantitySDCtThresholdA1STANDARD8.24888.25270.00551000000000.0712A2STANDARD8.25658.25270.00551000000000.0712B1STANDARD11.389311.65980.3825100000000.0712B2STANDARD11.930311.65980.3825100000000.0712C1STANDARD15.329214.96680.512610000000.0712C2STANDARD14.604314.96680.51

5、2610000000.0712D1STANDARD19.491219.30800.25901000000.0712D2STANDARD19.124919.30800.25901000000.0712E1STANDARD22.538522.41960.1681100000.0712E2STANDARD22.300722.41960.1681100000.0712F1UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.6250.0712F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.6250.

6、0712G1NTC32.53290.0712G2NTC32.95490.0712其中,A-E为标准样品,F为位置样品,G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软件分析,由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83×107。(2)、扩增曲线从扩增曲线中可以看出,样品均经历了良好的扩增过程。(3)、标准曲线从标准曲线中可以看出,R2值较好,标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其中106和107的两个平行样的CT偏差较大,这一现象可以从(1)表中看出,其SD分别为0.5126和0.3825,相比其他点较大,一般认为SD大于0.5不理想。(4)、融解曲线图中,可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的

7、温度范围内(82~86℃),所以扩增是正常的,不存在非特异性扩增。2、实验过程中需要注意些什么细节?答:(1)、操作过程中尽量不要说话,以避免污染;(2)、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下,这样样品不会留在管壁上;(3)、不能在定量PCR管做标记,裸手不可以接触定量PCR管,操作时应戴手套。(4)、8联定量PCR管加完样后,可先将盖子放上,等放到振荡机上再把盖子盖紧。3、通过这个实验你有什么收获?这个实验对你今后开展相关实

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