7300安装培训实时定量pcr实验

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1、ABIPrism®7300型荧光定量PCR仪安装培训美国应用生物系统中国公司技术服务部2004年1培训内容1、仪器简况2、定量PCR的数学原理3、定量PCR的化学原理4、等位基因鉴定原理5、定量PCR实验操作6、定量PCR的数据处理7、应用举例2仪器简况7300功能一览•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)–自动计算基线、阈值、C值、浓度、百分比T•相对定量(RelativeQuantification，RQ)–RQPlate：控制实验–RQStudy：计算数据，最多10块RQPlates•等位基因分型(AllelicDiscrimination，AD)•阴

2、性阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC，+/-)47300选用的荧光组合报告荧光(FilterA)FAM™或SYBR®Green报告荧光(FilterB)VIC™或JOE™淬灭或报告荧光(FilterC)TAMRA™或NED™参比荧光(FilterD)ROX™5相对定量数据自动处理选配软件6定量PCR的数学原理PCR曲线有两种表达形式线性图谱对数图谱8PCR分4个阶段平台期线性增长期指数增长期基线期9起点定量与终点定量ò起始DNA量是“天然”的量，更有意义；终点DNA量是经过PCR“加工”的量，存在部分“失真”ò起点定量重现性好，终点定量误差大终点：误差大同一个样品重复96次

3、起点：重现性好10C值测定起始DNA浓度T定义：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数C值必须位于指数增长阶段内T线性图谱半对数图谱C值C值TT11标准曲线C=-klogX+bT0CT起始DNA浓度X0基线决定阈值阈值决定C值T基线确定原则第3个循环~C值前4个循环T起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的C值–4，通常为15T长度：大于或等于6个循环基线调整原则如果C值>18，使用3-15，不需调整T如果C值<18，终点减小到(C值–4)TT阈基线值13C值T定量PCR的化学原理两种定量化学•染料法–SYBR®GreenI•探针法–TaqManTM探针–TaqManMGB探针1

4、5TaqMan探针法forwardprimerRprobeQ5'3'3'5'5'3'R5'Qreverseprimer5'3'1.聚合3'5'5'3'5'2.链取代RQ5'3'3'5'RQ5'3'5'5'3.探针被切断3'5'5'3'3'5'R=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher4.聚合完成16TaqManMGB探针法(non-fluorescentquencher)NFQQRQAGGCCTTGAGAGATATMGB(minorgroovebinder)RQAGGCCTTGAGAGATAT

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20、GCTACACAGTCCGGAACTCTCTA

21、TAGCATCACACR报告荧光NFQ无荧光淬灭基团MGB小沟结合物17MGB探针能够分辨1个碱基的差别完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号FAMMGB18SYBRGreen染料法SYBRGreenI是一种DNA小沟结合染料与DNA结合时发光游离时不发光19染料法的优点和缺点成本低不需要探针适合初步筛查先用SYBR筛查，需要时再用TaqMan精确定量兼容熔解曲线鉴定有无PCR杂带、有无引物二聚体不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号灵敏度低适合于5000拷贝以上的基因定量20熔解曲线(Dissociationcurve)只

22、有染料法才能做、也才需要做熔解曲线探针法做不了、也没有必要做[原始数据][导数图谱]21多重荧光定量原理使用两条探针，标记两种颜色，针对两个基因目标基因1目标基因222等位基因鉴定原理正常与突变探针在同一管里反应野生型(wt)突变型(mut)¾将SNP及突变位点置于探针的中央¾Quencher为TAMRA或者MGB/NFQ24终点实验数据2/2纯合子1/1纯合子1/2杂合子实时结果空白对照25SNP实验分两步进行混合试剂PCR试剂+引物探针+2ng样品实时循环终点读板ABIPRISM®7000SDS分析数据26定量PCR实验操作96-孔板设置举例阳性对照标准品阴性对照未知样品28标准

23、的数据分析步骤1.实验结束，软件根据默认值(3-15)自动分析给出初步C值T2.如果实验中最小的C值<18，根据[最小的C值-4]TT得出准确的基线终点；如果C值>18，终点取15T3.基线起点：进口试剂取3，国产试剂取64.设定新的起点和终点，重新分析数据得出精确的C值T5.在PCR反应正常的前提下，调整前后C值相差不大T29引物和探针1.推荐所有的用户到AB公司的网站上查询现成的试剂盒，价格比国内合成更便宜，质量比国内试剂高10倍，保质期更长，成功率有