两种高效液相色谱系统灵敏检测血浆中双酚a的方法

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1、两种高效液相色谱系统灵敏检测血浆中双酚A的方法摘要：这篇文章的目的是建立一种简单准确检测血清、尿液等体液屮双酚A的方法。两种高效液相色谱系统（HPLC），11PLC联合电化学检测器（ED）和IIPLC联合质谱检测，使用电喷雾离子源（ESI）作为连接，共同检测固相萃取血清屮BPA的样品。水或者50%浓度以下的乙醇可有效地萃取血清屮的BPA。HPLC-ED的检测限为0.2ng/ml,HPLC-MS的检测限为0.lng/ml。两个11PLC系统所得到的数据具有很好的相关性。正常人类的血清屮BPA的浓度较低（0-1.6ng/ml）。在牛的胚胎血清和羊的血液屮均发

2、现相当浓度的BPA。但是在刚刚采集到的新鲜羊血中并没宥发现BPA。我们认为血液在采集盾准备阶段的操作过程中产生了BPA。在用PC离心管做实验吋发现聚碳酸酯瓶的BPA浸入血液屮的量是浸入水屮的40倍，且浸入量与温度冇关（37°C〉20°C>5°C）。关键词：双酚A1.介绍：CJ从1993年，Krishman等证明聚碳酸酯瓶在高温灭菌的过程中会产生双酚A,并且会刺激人体产生雌激素以来。BPA对人体健康是否会产生影响就一直是一个有争论的话题。据报道树脂底物和牙科用密封剂会产生大量的BPA,已经宥许多研究指出BPA存在于CJ然环境、婴儿奶瓶、塑料废弃物的水体中。

3、由于缺乏合适的检测生物样品屮BPA浓度的方法，现在还不知道多大浓度的BPA会对人体健康造成危害。目前，气象色谱质谱（GC-MS）和高效液相色谱-紫外荧光法通常用于检测水样中的BPA,而11PLC-MS也已经广泛用于生物样品屮BPA的分析。此外，电喷雾离子源用来连接质谱可以将不稳定的化学成分如蛋白质、多肽、核酸以及二十烷类去晶体化和离子化。Youkubo提出直接用HPLC-MS分析检测水样中的BPAo他认为在三种离子化方法（ESI、EI和APCI）屮ESI的灵敏性最好。另一方而，电化学检测器（ED）现在也广泛用于分析具有较高特异性的酚类化合物。因此我们确定

4、了一种便捷、准确检测BPA的方法，即使用两种HPLC系统，一个与ED连接，一个使用ESI-MS。在这次试验中，我们将分析不同实验材料屮BPA的含量。2.实验部分2.1材料从日本制药公司购买牛胚胎血清和羊的血浆。从WAKO化学公司购得BPA。聚碳酸脂离心管从NalgerwncW际公句获得。干燥冷冻的商用血清蛋白从H本畜牧产业公司获得，蛋白在水中的溶解浓度为5g/l。新鲜的羊血是从三只家养羊的腿部血管中收集到的。人体的血液来自21名(9女，12男)健康的闩本成年志愿者，年龄分布在30-50之间。100g人体血红细胞经过十分钟离心分离出血将、血清。为避免受到B

5、PA污染，玻璃注射器和试管在使用_前都要经过99%乙醇清洗。试验屮BPA的水溶液有ODS-silica>scp-pak制备。OasisHLB用来固相萃取BPA,使用3.5ml屮醇和3.5ml水进行冲洗。使用乙酸乙酯作为洗脱液。每次试验前都要做BPA的空白检测确保没宥BPA污染。2.2从血浆和血清中提取BPA0.2-0.5ml血浆或血清用超纯水稀释到5ml。样品适用于Sep-pak，用3.5ml的乙醇分离溶液中的极性脂类，用3.5ml石油醚分离溶液中的非极性脂类。最后，用3.5ml乙酸乙酯萃取BPA。萃取液用氮气吹干。残留物溶解在乙腈-水(40:60)的溶

6、液屮。BPA标准曲线用lug/ml原料溶于25%甲醇中制成。2.3实验时从PC管中提取血浆中的BPA和水2ml不含BPA的新鲜羊血浆分别保存在3个PC离心管屮，他们各自的保准温度为37°C、20°C、5°C。每天从各个管中提取0.2ml用于BPA的检测，为防止BPA污染，在操作过程中只是用超纯水。2.4高效液相色谱和质谱的操作条件其屮一个HPLC系统的型号为LC-10AD,使用VP-ODS色谱柱(150mmX4.6mm)和电化学检测器(ConlochenII5200A)。流动相使用乙腈-水-磷酸(40:60:0.2)。流速为l.Oml/min,色谱柱温度

7、为4(TC。注入的样品量为50ul。ED使用条件：保护细胞电势E600mV,分析细胞电势E：300mV,和E2550mV;电流均为luAo鉴定BPA耍使用色谱分析法将11PLC中BPA的出峰时间与标准曲线的吋间进行比较。对于一个完整的分析，BPA的峰值保留吋间要由GC-MS确认。另一个HPLC系统是Alliana2690型,同时要使用3.5umC18萃取柱和ZMD喷雾质I普仪，联合ESI电喷雾接口。流动相是乙腈-水(40:60)。流速和色谱柱温度分别为0.25ml/min和40°C。ESI阴离子扫描条件:毛细管电压3.5KV;岡锥电压39V;分析电压59

8、V;反溶剂温度390°C。注入样品量20ul。3.结果试验中，在BPA的洗涤和分